厦门大学：《现代生物实验学》课程教学课件（PPT讲稿）实验八、聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳.ppt_大学文库

实验八 SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质

一、目的要求 1.学习电泳原理和技术 2.学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术

二、原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N— methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N， N ，N ， N—四甲基乙二胺 (N， N ，N ，N— tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4 )2S2O8，简称 AP) 或核黄素 (ribofavin 即 vita min B2 ， C17H20O6N4 )的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称 PAGE)

 聚丙烯酰胺凝胶有下列特性： (1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； (2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶； (3)对pH和温度变化较稳定； (4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好； (5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g (6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； (7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率

 凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围适用的凝胶浓度/(%) 蛋白质 104 20-30 1-4×104 15-20 1-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10 5×105 2-5 核酸(RNA) 104 15–20 104–105 5-10 105-2×106 2-2.6

 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。  目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)，两者电泳原理完全相同

图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A为正面,B为剖面) (1)样品胶pH6.7 (2)浓缩胶pH6.7 (3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3

图2 夹心垂直板电泳槽示意图图3 凝胶模示意图 1.样品槽模板 2.长玻璃板 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统返回

 不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、 2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素

（1）样品浓缩效应 (a)凝胶孔径不连续性： (b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；  在pH6.7的凝胶缓冲体系中前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1 - ) 尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根 mclcl>mpp>mGG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根)有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度)  当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；（c)电位梯度的不连续性： (2)分子筛效应 (3)电荷效应