厦门大学：《现代生物实验学》课程教学课件（PPT讲稿）实验七、凝胶过滤层析

实验七 凝胶过滤层析纯化细胞 色素C

实验七 凝胶过滤层析纯化细胞 色素C

一、目的要求 1.学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的 原理与方法。 2.通过凝胶过滤柱层析对细胞色素C进行纯 化

一、目的要求 1.学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的 原理与方法。 2.通过凝胶过滤柱层析对细胞色素C进行纯 化

二、原理  凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用 具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物 质的分子大小不同来进行分离

二、原理  凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用 具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物 质的分子大小不同来进行分离

89g0 Porous polymer beads 平0 Protein mixture is added to column containing cross-linked polymer. Protein molecules separate by size:larger molecules pass more freely,appearing in the earlier fractions. 12345 (b)

 内水体积Vi  外水体积Vo  柱床体积Vt  洗脱体积Ve  Vt=Vo+Vi+Vg  Ve=Vo+KdVi  Kd=(Ve -Vo )/Vi

 内水体积Vi  外水体积Vo  柱床体积Vt  洗脱体积Ve  Vt=Vo+Vi+Vg  Ve=Vo+KdVi  Kd=(Ve -Vo )/Vi

 Kd=0  Kd=1  01

 Kd=0  Kd=1  01

 优点： a. 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析 柱可反复使用  凝胶的类型： Sephadex: 交联葡聚糖 Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel A Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛 Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝 胶 G-10 G-15 G-25 G-50 G-75 G-100 G-150 G-200 吸水量 （g/g干凝 胶） 1.0 1.5 2.5 5.0 7.5 10.0 15.0 20.0 工作范围 （肽与蛋 白）D <700 <1500 <5000 1500- 20000 3000- 70000 4000- 150000 5000- 300000 5000- 500000

 优点： a. 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析 柱可反复使用  凝胶的类型： Sephadex: 交联葡聚糖 Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel A Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛 Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝 胶 G-10 G-15 G-25 G-50 G-75 G-100 G-150 G-200 吸水量 （g/g干凝 胶） 1.0 1.5 2.5 5.0 7.5 10.0 15.0 20.0 工作范围 （肽与蛋 白）D <700 <1500 <5000 1500- 20000 3000- 70000 4000- 150000 5000- 300000 5000- 500000

 凝胶及柱的选择

 凝胶及柱的选择

•凝胶的处理及装柱 凝胶干粉的溶胀（热溶 胀）、浮选、抽气、装 柱、蓝色葡聚糖检查、 平衡 装柱时要注意操作压

•凝胶的处理及装柱 凝胶干粉的溶胀（热溶 胀）、浮选、抽气、装 柱、蓝色葡聚糖检查、 平衡 装柱时要注意操作压

装柱的两种方法： a.手工操作 1/3床体积水→加入少许凝胶积起1-2 厘米凝胶床→打开出水口→连续缓慢 加入凝胶 b.电动搅拌下的装柱法 （如图4-9）

装柱的两种方法： a.手工操作 1/3床体积水→加入少许凝胶积起1-2 厘米凝胶床→打开出水口→连续缓慢 加入凝胶 b.电动搅拌下的装柱法 （如图4-9）