厦门大学：《现代生物实验学》课程教学课件（PPT讲稿）实验五、碱性磷酸酶米氏常数的测定

实验五 碱性磷酸酶米氏常 数的测定

实验五 碱性磷酸酶米氏常 数的测定

一、目的要求 1.学习分光光度法测定的原理和方法 2.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度 （Vm）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶 在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km 和Vm值

一、目的要求 1.学习分光光度法测定的原理和方法 2.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度 （Vm）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶 在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km 和Vm值

二、原理 一、分光光度法的基本原理及方法 （一）利用吸收光谱对物质进行定性分析 1．原理

二、原理 一、分光光度法的基本原理及方法 （一）利用吸收光谱对物质进行定性分析 1．原理

2．主要方法： （1）比较吸收光谱曲线 （2）比较最大吸收波长 蛋白质的最大吸收波长为280nm，核酸的最大吸收波长 为260nm。 1.苯丙氨酸 2.酪氨酸 3.色氨酸

2．主要方法： （1）比较吸收光谱曲线 （2）比较最大吸收波长 蛋白质的最大吸收波长为280nm，核酸的最大吸收波长 为260nm。 1.苯丙氨酸 2.酪氨酸 3.色氨酸

（3）比较吸光度的比值 纯DNA 1.8 280 260 = nm nm A A

（3）比较吸光度的比值 纯DNA 1.8 280 260 = nm nm A A

（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析 1．原理 Beer-Lambert（比尔）定律： T=I/I0 A=lg1/T=lgI0 /I A=KCL 其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射 光强度；I为透射光强度； K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光 程的厚度

（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析 1．原理 Beer-Lambert（比尔）定律： T=I/I0 A=lg1/T=lgI0 /I A=KCL 其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射 光强度；I为透射光强度； K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光 程的厚度

2．常用方法 （1）标准曲线法 OD或Ａ 浓度  标准曲线与样品的测定条件必须一致

2．常用方法 （1）标准曲线法 OD或Ａ 浓度  标准曲线与样品的测定条件必须一致

（2）标准管法 CX /AX=CS /AS，已知CS，测定AS、AX，可 求得CX。 （3）摩尔吸光系数法 C=A/（为L=1cm，C为1 mol/L时的 吸光系数，也称为摩尔吸光系数

（2）标准管法 CX /AX=CS /AS，已知CS，测定AS、AX，可 求得CX。 （3）摩尔吸光系数法 C=A/（为L=1cm，C为1 mol/L时的 吸光系数，也称为摩尔吸光系数

(三)米氏常数的测定原理 酶促反应v-[S]曲线 v [S] 推导出米氏方程为： 其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度； Km 为米氏常数 [ ] [ ] K S V S v m m + =

(三)米氏常数的测定原理 酶促反应v-[S]曲线 v [S] 推导出米氏方程为： 其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度； Km 为米氏常数 [ ] [ ] K S V S v m m + =

米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含 着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能 够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反 映出酶与各种底物的亲和力的强弱。 测定Km和Vm，可通过作图法求得。 最常用的 Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米 氏方程转化为倒数形式，即： 以1/v对1/[S]作图，可得一条直线 m m m V S V K v 1 [ ] 1 1 =  +

米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含 着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能 够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反 映出酶与各种底物的亲和力的强弱。 测定Km和Vm，可通过作图法求得。 最常用的 Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米 氏方程转化为倒数形式，即： 以1/v对1/[S]作图，可得一条直线 m m m V S V K v 1 [ ] 1 1 =  +