沈阳师范大学：《细胞生物学实验》课程教学资源（教案讲义）实验七 动物细胞培养的无菌化准备——实践

实验七动物细胞培养的无菌化操作

实验七 动物细胞培养的无菌化 操作

思维导图基本实验室国、辅助实无菌室的基本设计验室动物细胞实验室净化台、C02、培养箱无菌室的基本设备基本配置留置显微镜等培养器血、盛装器血、培养所需器皿金属材质用具等动物细胞基本培养液、血清、PBS、胰蛋白酶溶液等级辣动物细胞培养基本试剂无菌、ph、分装、储存清洗包装动物细胞培养物理消毒，干热灭菌基本准备灭菌与消毒湿热灭菌，滤过除菌，化学消毒等无菌操作

无菌操作 无菌室的基本设计 无菌室的基本设备 培养所需器皿 基本培养液、血清、PBS、胰蛋白酶溶液等 无菌、ph、分装、储存 基本实验室国、辅助实 验室 净化台、CO2、培养箱、 留置显微镜等 培养器皿、盛装器皿、 金属材质用具等 清洗 包装 灭菌与消毒 物理消毒, 干热灭菌, 湿热灭菌,滤过除菌,化 学消毒等 动物 细胞 实验 室及 基本 操作 动物细胞培养 基本准备 动物细胞培养 基本试剂 动物细胞实验室 基本配置 思维导图

一、实验目的(1）掌握动物细胞培养室的基本设置和仪器配置。（2）了解动物细胞培养相关的试剂。(3）掌握细胞培养无菌化准备流程：房间，仪器，试剂

一 、实验目的 （1）掌握动物细胞培养室的基本设置和仪器配置。 （2）了解动物细胞培养相关的试剂。 （3）掌握细胞培养无菌化准备流程：房间，仪器，试剂

二、实验原理·无菌操作技术是细胞工程相关技术操作中的重要实验条件，只有在无菌的条件下，才能正确的模拟动物细胞、组织、器官等生物学材料正常生长、发育、改造所需的各种环境。·无菌操作，是指在无菌室或超净台中进行以防止微生物进入人体或污染供试菌的操作技术。·无菌操作是各种生物实验和生产实践中一项重要的基本操作。。无菌操作的要求是：操作前将操作空间中的细菌和病毒等微生物杀灭；操作过程中保证操作空间与外界隔离，避免微生物的侵入

二、实验原理 • 无菌操作技术是细胞工程相关技术操作中的重要实验条件，只有在无菌的 条件下，才能正确的模拟动物细胞、组织、器官等生物学材料正常生长、 发育、改造所需的各种环境。 • 无菌操作，是指在无菌室或超净台中进行以防止微生物进入人体或污染供 试菌的操作技术。 • 无菌操作是各种生物实验和生产实践中一项重要的基本操作。 • 无菌操作的要求是：操作前将操作空间中的细菌和病毒等微生物杀灭；操 作过程中保证操作空间与外界隔离，避免微生物的侵入

三、实验试剂及器械（1）试剂：洁而灭、甲酚皂，现配现用。（2）仪器：倒置显微镜、二氧化碳恒温培养箱、超净工作台等（3）器血：滴管、离心管(4）自制酒精棉球

三、实验试剂及器械 （1）试剂：洁而灭、甲酚皂，现配现用。 （2）仪器：倒置显微镜、二氧化碳恒温培养箱、超净工作台等 （3）器皿：滴管、离心管 （4）自制酒精棉球

四、实验步骤第一次课：完成器血清洗工作第二次课：操作台准备，无菌室无菌化，相关器血消毒2酒精灯2试管架2大的广口瓶1条培养瓶1袋PE手套每个操作台1大镊子195%酒精1打火机2记号笔1手推车

四、实验步骤 每个操作台 酒精灯 2 试管架 2 大的广口瓶 2 培养瓶 1条 PE手套 1袋 大镊子 1 95%酒精 1 打火机 1 记号笔 2 手推车 1 第一次课：完成器皿清洗工作 第二次课：操作台准备，无菌室无菌化，相关器皿消毒

(1)使用过的玻璃器血，耐酸塑料的清洗使用过的培养用品应立即浸入清水，加入洗涤剂，避免干难洗清洗玻璃器血，自来水清洗数遍，倒置自然干燥，浸酸性洗液，浸没，过夜。从酸性洗液捞出后，自来水冲洗10-15次去除残余酸液4去离子水涮洗5次。倒置烘干。5包装（牛皮纸或医用饭盒）。6)?灭菌，贮存备用

① 使用过的培养用品应立即浸入清水，加入洗涤剂，避免干涸难洗。 ② 清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥。 ③ 浸酸性洗液，浸没，过夜。 ④ 从酸性洗液捞出后，自来水冲洗10-15次去除残余酸液， 去离子水涮洗5次。 ⑤ 倒置烘干。 ⑥ 包装(牛皮纸或医用饭盒) 。 ⑦ 灭菌，贮存备用。 （1）使用过的玻璃器皿,耐酸塑料的清洗

(2)无菌室的无菌化(1））清洁纱布沾取洁而灭第一次擦，除灰无菌室内一切台面及仪器，按照超净台内部、倒置显微镜、桌面、离心机的顺序，二氧化碳培养箱需要单独擦拭，先内后外的原则。（2）第二次擦，消毒按照上述顺序，纱布不能反复使用为原则。(3）E甲酚皂清理地面二次，分别由里至外，不要反复

（1）清洁纱布沾取洁而灭第一次擦拭，除灰 无菌室内一切台面及仪器，按照超净台内部、倒置显微镜、桌 面、离心机的顺序，二氧化碳培养箱需要单独擦拭，先内后外的原 则。 （2）第二次擦拭，消毒 按照上述顺序，纱布不能反复使用为原则。 （3）甲酚皂清理地面 二次，分别由里至外，不要反复。 （2）无菌室的无菌化

(3）湿热灭菌后，移入无菌室，紫外照射30min①首先查看高压锅内的水是否充足，放入物品盖好盖。②加热灭菌锅锅。将放气阀打开，放气5一10min，以排除锅内的冷空气。③落下放气阀继续升温升压，玻璃器血等用15磅(121℃）30min，胶塞、塑料制品、溶液等可用10磅(115℃)20 min。④停止加热，待压力自然下降至0再打开放气阀排汽，开盖，取出高压灭菌的物品烘干

（3）湿热灭菌后，移入无菌室，紫外照射30min

五、注意事项·房间打扫彻底，紫外照射。注意用酸安全，清洗彻底，勿徒手拿浸酸后的器血；·包装时，注意带手套，勿恣意聊天。·注意灭菌锅水位！·酒精棉球大小合适，酒精切勿过多。·按组操作，各人使用各人物品

五、注意事项 • 房间打扫彻底，紫外照射。 • 注意用酸安全，清洗彻底，勿徒手拿浸酸后的器皿； • 包装时，注意带手套，勿恣意聊天。 • 注意灭菌锅水位！ • 酒精棉球大小合适，酒精切勿过多。 • 按组操作，各人使用各人物品