清华大学：现代生命科学实验教学中心《普通生物学实验》课程教学课件（讲稿）烟草幼苗的组织培养

烟草幼苗的组织培养自的与要求掌握植物组织培养中无菌操作技术学习用生长调节剂对植物器官发生的诱导方法

烟草幼苗的组织培养 一、目的与要求 掌握植物组织培养中无菌操作技术 学习用生长调节剂对植物器官发生的诱导方法

实验原理二、 组织、器植物组织培养在无菌条件下，将植物体的一部分细胞、组织、器官，官切割下来，接种到营养介质上，使其增殖成一群细胞、甚至完整植物体的实验技术植物细胞全能性植物体的每个活细胞都有相同的遗传组成，在适当条件下具有繁殖出完整植株的能力脱分化已经分化的细胞，发生生理、生化的改变，退回到胚性细胞的过程。再分化经过退分化的细胞或组织再次获得分化成不同功能的细胞、组织、器官或完整植物体。改变生长素NAA和细胞分裂素6-BA浓度比例，可以决定烟草幼苗从叶片直接分化生成根或芽2，4-D能够诱导生成愈伤组织

二、 实验原理 植物组织培养 在无菌条件下，将植物体的一部分细胞、组织、器 官切割下来，接种到营养介质上，使其增殖成一群细胞、组织、器官， 甚至完整植物体的实验技术。 植物细胞全能性 植物体的每个活细胞都有相同的遗传组成，在适 当条件下具有繁殖出完整植株的能力。 脱分化 已经分化的细胞，发生生理、生化的改变，退回到胚性 细胞的过程。 再分化 经过退分化的细胞或组织再次获得分化成不同功能的细 胞、组织、器官或完整植物体。 改变生长素NAA和细胞分裂素6-BA浓度比例，可以决定烟草幼苗从 叶片直接分化生成根或芽。 2，4-D能够诱导生成愈伤组织

三、材料和用具材料：烟草幼苗器具：超净工作台高压灭菌锅光照培养箱三角烧瓶等试剂：MS培养基wwwensy.comNAA6-BA2, 4-D

三、材料和用具  材料：烟草幼苗  器具：超净工作台 高压灭菌锅 光照培养箱 三角烧瓶等  试剂：MS培养基 NAA 6-BA 2，4-D

诱导培养基配制用量成分终浓度要求大量元素10%(10X)蒸馏水（3/4总体积）1%微量元素（100×）1%有机成分(100X)1%铁盐（100×）蔗糖3%加蒸馏水粗略定容3个实验组激素(0.1mg/ml)调pH5.8分30ml/瓶（组号、激素比例）琼脂0.8%10

诱导培养基配制 成 分 终 浓度要求 用 量 ① 大量元素（10×） 10% ② 蒸馏水（3/4总体积） ③ 微量元素（100× ） 1% ④ 有机成分（100×） 1% ⑤ 铁盐（ 100×） 1% ⑥ 蔗糖 3% ⑦ 加蒸馏水粗略定容 ⑧ 激素(0.1mg/ml) 3个实验组 ⑨ 调pH 分 30ml/瓶（组号、激素比例） 5.8 ⑩ 琼脂 0.8%

500mlStep1：配大瓶培养基（无激素）Step2：分瓶，加激素125ml调PH=5.8ctrl2,4-DNAA:6-BA=1:5NAA:6-BA=5:1Step3:分装，加琼脂30ml

500 ml 125ml 30ml Step1: 配大瓶培养基(无激素) Step 2: 分瓶,加激素, 调PH=5.8 Step 3:分装,加琼脂 ctrl NAA:6-BA=1:5 NAA:6-BA=5:1 2,4-D

四、操作步骤1.灭菌：(1)器具灭菌：剪、镊、培养皿，诱导培养基，120℃，高压灭菌15-20min；2)无菌间和超净台：紫外灯照射30min3)清洗手和手腕；(4)关掉无菌间棚顶及超净工作台上的紫外灯，打开超净台风机，用70%酒精灭福喷手；(5)坐在超净工作台前，用70%酒精棉球擦双手、培养基瓶和超净台面；(6)点燃酒精灯

四、操作步骤 1.灭菌： (1)器具灭菌： 剪、镊、培养皿，诱导培养基， 120℃，高压灭菌15-20min； (2) 无菌间和超净台: 紫外灯照射30min； (3) 清洗手和手腕 ； (4) 关掉无菌间棚顶及超净工作台上的紫外灯，打开超净台风机，用70%酒精灭 喷手； (5) 坐在超净工作台前，用70%酒精棉球擦拭双手、培养基瓶和超净台面； (6) 点燃酒精灯

四、操作步骤2. 接种将装有培养基的三角烧瓶橡皮筋解开（不掀开封口膜），放到无菌风道侧面。将镊子、剪取烟草叶。剪刀在酒精灯外焰上灼烧，待其冷却后、取下封口膜，手持三角瓶，瓶口略倾斜，将叶片插入培养基。在酒精灯火焰上灼烧数秒（阻断微生物进入），盖好封口膜，扎紧橡皮筋。瓶上写上姓名。剪刀、将培养瓶、镊子带回实验室。3.培养在光照培养箱中培养4周，25℃，光照16h，暗期8h，湿度70%-80%

四、操作步骤 2. 接种 ① 将装有培养基的三角烧瓶橡皮筋解开（不掀开封口膜），放到无菌风道 侧面。 ② 将镊子、剪刀在酒精灯外焰上灼烧，待其冷却后、剪取烟草叶。 ③ 取下封口膜，手持三角瓶，瓶口略倾斜，将叶片插入培养基。 ④ 在酒精灯火焰上灼烧数秒（阻断微生物进入），盖好封口膜，扎紧橡皮 筋。 ⑤ 瓶上写上姓名。 ⑥ 将培养瓶、剪刀、镊子带回实验室。 3. 培养 在光照培养箱中培养4周，25℃，光照16h，暗期8h，湿度70%-80%

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五、无菌操作注意事项1.无菌操作时不要讲话，以免污染；2.用酒精对双手消毒时，务必待酒精彻底挥发后再靠近酒精灯火焰，以免火焰伤手3.进出无菌间关好缓冲间的推拉门

五、无菌操作注意事项 1. 无菌操作时不要讲话，以免污染； 2. 用酒精对双手消毒时，务必待酒精彻底挥发后再靠近酒 精灯火焰，以免火焰伤手。 3. 进出无菌间关好缓冲间的推拉门

七、作业填写培养基配制表12.每周观察一次并做记录3.实验中的6-BA、NAA各有什么作用？不同混合比例有什么差异？4.什么是细胞全能性？

七、作业 1. 填写培养基配制表。 2. 每周观察一次并做记录。 3. 实验中的6-BA、NAA各有什么作用？不同混合比例有什 么差异？ 4. 什么是细胞全能性？