沈阳师范大学：《细胞生物学实验》课程教学资源（教案讲义）实验七 动物细胞培养的无菌化准备——理论

回顾1.显微镜的“专业”操作。国胞清果2.标准的生物科研绘图。3.暗视野下神奇的世界。4.实验设计：单盲、双盲、阳性对照阴性对照。5.误差的产生、组内重复、组间差异和组内差异。6.染色：①詹纳斯绿B染色②中性红染色③考马斯亮蓝染色7.单细胞获得的方法、细胞融合的方法及应用

回顾 1.显微镜的“专业”操作。 2.标准的生物科研绘图。 3.暗视野下神奇的世界。 4.实验设计：单盲、双盲、阳性对照、 阴性对照。 5. 误差的产生、组内重复、组间差异 和组内差异。 6.染色：①詹纳斯绿B染色 ②中性红染色 ③考马斯亮蓝染色 7.单细胞获得的方法、细胞融合的方法 及应用

实验七动物细胞培养的无菌化准备第一节动物细胞培养实验室及仪器设备第二节动物细胞培养的基本试剂第三节动物细胞培养的基本操作

实验七 动物细胞培养的 无菌化准备 第一节 动物细胞培养实验室及仪器设备 第二节 动物细胞培养的基本试剂 第三节 动物细胞培养的基本操作

基本实验室国、辅助实无菌室的基本设计验室动物细胞实验室净化台、CO2培养箱、无菌室的基本设备倒置显微镜等基本配置培养器血、盛装器皿、培养所需器血金属材质用具等动物细胞基本培养液、血清、PBS、胰蛋白酶溶液等实验动物细胞培养室及基本试剂无菌、ph、分装、储存基本操作清洗包装动物细胞培养物理消毒，干热灭菌，湿基本准备灭菌与消毒热灭菌，滤过除菌，化学消毒等无菌操作

无菌操作 无菌室的基本设计 无菌室的基本设备 培养所需器皿 基本培养液、血清、PBS、胰蛋白酶溶液等 无菌、ph、分装、储存 基本实验室国、辅助实 验室 净化台、CO2培养箱、 倒置显微镜等 培养器皿、盛装器皿、 金属材质用具等 清洗 包装 灭菌与消毒 物理消毒, 干热灭菌,湿 热灭菌,滤过除菌,化学消 毒等 动物 细胞 实验 室及 基本 操作 动物细胞培养 基本准备 动物细胞培养 基本试剂 动物细胞实验室 基本配置

外植体(explants)离体条件下生物有机体的组织，器官，细胞，乃至细胞器都会作为我们的培养对象。原BJ6tnewsphotoC原代接种后10天（×400）D原代成油红O染色X400图细胎形态学观察

外植体（explants）： • 离体条件下生物有机体的组织，器官，细 胞，乃至细胞器都会作为我们的培养对象

如果，我们试图在体外培养动物的外植体（eg:肝脏细胞），我们需要为它提供什么样的环境

如果， 我们试图在体外培养动物的外植体 （eg:肝脏细胞）， 我们需要为它提供什么样的环境？

体外培养根本原则是模拟体内的生长条件（1）生长环境(PH值、温度等）恒定的温度：36.5℃C±0.5最适PH：7.2-7.4(2)营养供给培养基，培养液(3)无菌环境（无菌操作）C

体外培养根本原则是模拟体内的生长条件： 恒定的温度：36.5℃±0.5℃ 最适PH：7.2-7.4 （2）营养供给 培养基，培养液 （1）生长环境 （PH值、温度等) （3）无菌环境（无菌操作）

第一节动物细胞培养实验室及仪器设备

第一节 动物细胞培养实验室及仪器设备

1．基础实验室设计上的共同原则：无菌操作。基本操作区：洗涤区，灭菌区，储藏区，培养基配制区无菌操作室：缓冲准备室，接种室：培养室：恒温培养箱，培养架，摇床，倒置显微镜，等仪器。鉴定分析室：

1．基础实验室 设计上的共同原则：无菌操作。 基本操作区：洗涤区，灭菌区，储藏区，培养基配制区； 无菌操作室：缓冲准备室 ，接种室； 培 养 室：恒温培养箱，培养架，摇床， 鉴定分析室：倒置显微镜，等仪器

无菌操作台区接种复缓冲准

缓冲准 备区 接种 区 无菌操作台

操作室的级别NK美国联邦标准（USAFederalStandard）空气中微粒的洁净等级对照空气微粒洁净等级（每立方米，每立方英尺）微粒的最大浓度限值ISO14644-1FEDSTD209ECLASSNumberofParCubicMeterbyMicrometerSize0.2um0.3um0.5um0.5umIsoClassEnglishMetric0.1um5umm3m3m3f3m321ISO1102104IS021002631M1.51,000265106351S03410M2.510353IS0410.0002.6501.060295（百级）100M3.5IS0526,50010.6001003.530100.0006（千级）1,000M4.5IS06100035,3002931,000.000265.000106.0007万级）10,000M5.5IS0710000353.0002.9308（十万级）100.000M6.5IS081000003.530.00029.3009IS09293.000100000035.300.000

操作室的级别 • 无菌室：以控制生物细菌等为目的，细菌的直径一般在5微米以上。 • 洁净室：室内悬浮粒子浓度受控的环境，24 ℃ ，60%湿度， 百 万级、万级、千级、百级等。 • 使用高效空气过滤器达到无菌的目的，粒径以0.5微米的标尺。 • 无菌室：以控制细菌等为目的的，级别也和洁净室相同， • 主要需要检测浮游菌、沉降菌等菌落数。 • 要求：不宜过大，封闭性好，干燥清洁，对微生物污染有可控性