河北农业大学：《发酵工艺及设备》课程教学资源（实验指导）09 生物检测技术实验指导

实验一 ELISA 方法快速检测肉制品中的沙门氏菌 一、实验目的 掌握 ELISA 方法快速检测肉及肉制品中的沙门氏菌的具体方法及操作步骤。 二、实验原理 酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种常用的固相酶免疫测定方法,是在放射免疫分析理论 的基础上发展起来的一种非放射性标记免疫技术,具有灵敏度高、特异性强、重复性好,所用 试剂稳定、易保存,试验操作简便,结果判断客观等特点常用的 ELISA 测定方法有:根据检测 目的和操作步骤不同, ELISA 有 3 种基本方法。(1)双抗体(原)夹心法 (2)间接法 (3)竞争 法。其中竞争法由于具有反应重复性与完成性好的特点,它是目前使用较广泛的测定方法。 三、实验材料 1．包被缓冲液：碳酸盐缓冲液（pH9.6 , 0.1M） Na2CO3.10H2O 11.45g NaHCO3 5.04g NaN3 0.2g 蒸馏水加至 1000mL 2．稀释液 ： PBS(Ph7.4, 0.15M ) 0.2M Na2HPO4 40.5 mL 0.2M NaH2PO4 mL NaCl 8.2g 3．Tween 20 0.5 mL 蒸馏水加至 1000mL 4．洗涤液：NaCl -Tween NaCl 8.5g Tween 20 0.5 mL 蒸馏水加至 1000mL 5．底物溶液：磷酸盐-柠檬酸缓冲液（pH5.0） 0.1M 柠檬酸 24.3 mL 0.2M 磷酸氢二钠 25.7mL 蒸馏水加至 50mL 邻苯二胺 40 mg，溶解后避光保存。临用前加入 30% H2O2 0.15 mL 6．封闭液：0.2% BSA 溶液 7．沙门氏菌血清 8．辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体 9．终止剂 ：2M 硫酸 10．ELISA 板 11．酶标检测仪 12．移液枪 13．人工污染沙门氏菌的香肠制品一份。 四、实验步骤 (1)样品前增菌 18-24h. (2)样品包被:取样品 100μｌ/孔包被酶联板 4℃过夜，洗板 3 次。 (3)封闭:BSA 200μｌ/孔,37℃孵育 1ｈ，洗板 3 次。 (4)加入一抗 100μｌ/孔，洗板 3 次。 (5)加入酶标二抗 100μｌ/孔 37℃孵育 1ｈ，洗板 3 次。 (6)加入底物，37℃孵育 30ｍｉｎ。 (7)加入终止剂。 (8)读取结果。 五、实验结果 通过酶标检测仪读数判定检测结果。 六、思考题 为什么 ELISA 反应总是需要一定时间的孵育？ 实验二 PCR 检测乳品中金黄色葡萄球菌 一、实验目的

实验一 ELISA 方法快速检测肉制品中的沙门氏菌 一、实验目的 掌握 ELISA 方法快速检测肉及肉制品中的沙门氏菌的具体方法及操作步骤。 二、实验原理 酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种常用的固相酶免疫测定方法,是在放射免疫分析理论 的基础上发展起来的一种非放射性标记免疫技术,具有灵敏度高、特异性强、重复性好,所用 试剂稳定、易保存,试验操作简便,结果判断客观等特点常用的 ELISA 测定方法有:根据检测 目的和操作步骤不同, ELISA 有 3 种基本方法。(1)双抗体(原)夹心法 (2)间接法 (3)竞争 法。其中竞争法由于具有反应重复性与完成性好的特点,它是目前使用较广泛的测定方法。 三、实验材料 1．包被缓冲液：碳酸盐缓冲液（pH9.6 , 0.1M） Na2CO3.10H2O 11.45g NaHCO3 5.04g NaN3 0.2g 蒸馏水加至 1000mL 2．稀释液 ： PBS(Ph7.4, 0.15M ) 0.2M Na2HPO4 40.5 mL 0.2M NaH2PO4 mL NaCl 8.2g 3．Tween 20 0.5 mL 蒸馏水加至 1000mL 4．洗涤液：NaCl -Tween NaCl 8.5g Tween 20 0.5 mL 蒸馏水加至 1000mL 5．底物溶液：磷酸盐-柠檬酸缓冲液（pH5.0） 0.1M 柠檬酸 24.3 mL 0.2M 磷酸氢二钠 25.7mL 蒸馏水加至 50mL 邻苯二胺 40 mg，溶解后避光保存。临用前加入 30% H2O2 0.15 mL 6．封闭液：0.2% BSA 溶液 7．沙门氏菌血清 8．辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体 9．终止剂 ：2M 硫酸 10．ELISA 板 11．酶标检测仪 12．移液枪 13．人工污染沙门氏菌的香肠制品一份。 四、实验步骤 (1)样品前增菌 18-24h. (2)样品包被:取样品 100μｌ/孔包被酶联板 4℃过夜，洗板 3 次。 (3)封闭:BSA 200μｌ/孔,37℃孵育 1ｈ，洗板 3 次。 (4)加入一抗 100μｌ/孔，洗板 3 次。 (5)加入酶标二抗 100μｌ/孔 37℃孵育 1ｈ，洗板 3 次。 (6)加入底物，37℃孵育 30ｍｉｎ。 (7)加入终止剂。 (8)读取结果。 五、实验结果 通过酶标检测仪读数判定检测结果。 六、思考题 为什么 ELISA 反应总是需要一定时间的孵育？ 实验二 PCR 检测乳品中金黄色葡萄球菌 一、实验目的

掌握 PCR 检测乳品中金黄色葡萄球菌具体方法及操作步骤。 二、实验原理 聚合酶链反应(polymerase chain reaction ) 简称 PCR，是一种体外酶促合成反应，扩 增特定 DNA 片断的方法。该技术于 1985 年由美国的 Kary Mullis 等人首创并由美国 GETUS 公司开发。其原理是：在存在 DNA 模板、引物、dNTP、适当缓冲液(Mg2+)的反应体系中， 在热稳定 DNA 聚合酶的催化下，对一对寡核苷酸引物所界定的 DNA 片断进行扩增。这种 扩增是通过模板 DNA、引物之间的变性、退火(复性)、延伸等三步反应为一个周期，循环 进行，使目标 DNA 片段得以扩增。由于每一周期产生的 DNA 片断均能成为下一次循环的 模板，故 PCR 产物以指数形式增加，从而实现信号的放大。 本实验以金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶为靶基因进行检测。 三、实验材料 1．菌种：Staphylococcus aureus(金黄色葡萄球菌)－26003-21 2．乳制品：全脂乳、脱脂乳和奶酪均购自当地超市。 3．培养基：营养肉汤培养基 4．化学试剂：10xPCR buffer、dNTPs、TaKaRa Taq、DNA Marker DL2000， 5．引物： 正向引物：GCGATTGATGGTGATACGGTT 反向引物：AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC 6．实验仪器：PCR 仪、DXY-33A 型电泳仪、UVIpro 凝胶成像系统 四、实验步骤 1.将已人工污染的乳品 25ml 接入 225ml 营养肉汤培养基中，37℃振荡培养过夜 2.取 1ml 培养液于 1.5ml 离心管中，11000rpm，离心 1 分钟，弃去上清液 3.用灭菌的纯水洗涤菌体沉淀两次，再用 100ul 灭菌纯水溶解沉淀物 4.将菌悬液于沸水浴中煮沸 10 分钟，11000rpm，离心 1 分钟，取上清液，备用 5.PCR 反应体系：总反应体系 50ul。包括 5ul 10XPCR buffer ，4ul dNTPs 混合物，0.5ul 40umol 正向引物，0.5ul40umol 反向引物，0.25ul（5U/ul）Taq 酶，模板 2ul，水 37.75ul。 6.PCR 扩增程序：PCR 反应采用冷启动。94℃预变性 4 分钟，再按 94℃1 分钟－52℃0.5 分 钟－72℃1.5 分钟进行 35 个循环，最后 72℃延伸 3.5 分钟。 7.电泳检测：取 5ul PCR 产物在 2％琼脂糖凝胶上进行电泳，利用凝胶成像系统观察结果并 成像。 五.实验结果

掌握 PCR 检测乳品中金黄色葡萄球菌具体方法及操作步骤。 二、实验原理 聚合酶链反应(polymerase chain reaction ) 简称 PCR，是一种体外酶促合成反应，扩 增特定 DNA 片断的方法。该技术于 1985 年由美国的 Kary Mullis 等人首创并由美国 GETUS 公司开发。其原理是：在存在 DNA 模板、引物、dNTP、适当缓冲液(Mg2+)的反应体系中， 在热稳定 DNA 聚合酶的催化下，对一对寡核苷酸引物所界定的 DNA 片断进行扩增。这种 扩增是通过模板 DNA、引物之间的变性、退火(复性)、延伸等三步反应为一个周期，循环 进行，使目标 DNA 片段得以扩增。由于每一周期产生的 DNA 片断均能成为下一次循环的 模板，故 PCR 产物以指数形式增加，从而实现信号的放大。 本实验以金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶为靶基因进行检测。 三、实验材料 1．菌种：Staphylococcus aureus(金黄色葡萄球菌)－26003-21 2．乳制品：全脂乳、脱脂乳和奶酪均购自当地超市。 3．培养基：营养肉汤培养基 4．化学试剂：10xPCR buffer、dNTPs、TaKaRa Taq、DNA Marker DL2000， 5．引物： 正向引物：GCGATTGATGGTGATACGGTT 反向引物：AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC 6．实验仪器：PCR 仪、DXY-33A 型电泳仪、UVIpro 凝胶成像系统 四、实验步骤 1.将已人工污染的乳品 25ml 接入 225ml 营养肉汤培养基中，37℃振荡培养过夜 2.取 1ml 培养液于 1.5ml 离心管中，11000rpm，离心 1 分钟，弃去上清液 3.用灭菌的纯水洗涤菌体沉淀两次，再用 100ul 灭菌纯水溶解沉淀物 4.将菌悬液于沸水浴中煮沸 10 分钟，11000rpm，离心 1 分钟，取上清液，备用 5.PCR 反应体系：总反应体系 50ul。包括 5ul 10XPCR buffer ，4ul dNTPs 混合物，0.5ul 40umol 正向引物，0.5ul40umol 反向引物，0.25ul（5U/ul）Taq 酶，模板 2ul，水 37.75ul。 6.PCR 扩增程序：PCR 反应采用冷启动。94℃预变性 4 分钟，再按 94℃1 分钟－52℃0.5 分 钟－72℃1.5 分钟进行 35 个循环，最后 72℃延伸 3.5 分钟。 7.电泳检测：取 5ul PCR 产物在 2％琼脂糖凝胶上进行电泳，利用凝胶成像系统观察结果并 成像。 五.实验结果