《分子生物学》课程教学课件（讲稿）第八章 分子生物学技术（分子实验讨论课——问题）

分子生物学实验---讨论课问题要求：8部分问题，每组选1，制作ppt分组讲解（每组10-20分钟）建议用图示方法简明解释各个问题各组汇报时可以提出新的问题并解答，其他组也可以提问

分子生物学实验 -讨论课问题 要求：8部分问题，每组选1，制作ppt分组讲解（每组10-20分钟） 建议用图示方法简明解释各个问题 各组汇报时可以提出新的问题并解答，其他组也可以提问

E.coil基因组DNA提取(1)(3)+与T载体三组PCR扩增目的基因首种纯化和培养人4连接酶转化碱法抽提质粒中国收电动蓝白斑单菌落PBV220质粒PCR产物（目的基因）检测铸选至姐子、测序双醇动并回收双醇动并国收王双寿切质拉聘切产物目的基因醇切产物提取T互组质粒并国收T4连换票2轮PCR扩增、细胞总RNA的提取4三姐DNA聘团、连接构注表达载体pBV-dps-6hisRT-PCR实验流程图感安态转化pBV-dps-2x-6his制备PCR产物（目的基因）表达载体构注绿色框部分克隆（单菌落）为本学期要|菌体PCR鉴定双幕切、连接做的内容。筛选的阳性克隆互组DNA（融合基因表达载体）工程菌的诱导表达转化、第选及融台蛋白诱导表达案和+SDS-PAGE粉亲和层析表达产物检测纯化的目的蛋白1(5)(2)印迹法签定目的至白目的蛋白的功能签定

实验流程图 绿色框部分 为本学期要 做的内容

第一部分一一实验概况1通过分子生物学实验课程基础实验部分，我们完成了一个什么课题？2.分子生物学实验（基因工程实验或DNA重组技术）包括了哪几个主要环节？3.列表说明基础实验部分各个实验环节所使用的主要试剂？（至少5种）、各个实验环节所使用主要仪器设备和用途？（至少5种）4.实验过程中用到哪些生物实验材料？5.微量移液器的使用需要注意什么？6.基础实验部分每个环节的预期实验结果是怎样的（结果图）？7进入分子生物学实验室进行实验时有哪些注意事项？

第一部分——实验概况 1.通过分子生物学实验课程基础实验部分，我们完成了一个什么课题？ 2.分子生物学实验（基因工程实验或DNA重组技术）包括了哪几个主 要环节？ 3.列表说明基础实验部分各个实验环节所使用的主要试剂？（至少5 种）、各个实验环节所使用主要仪器设备和用途？（至少5种） 4.实验过程中用到哪些生物实验材料？ 5.微量移液器的使用需要注意什么？ 6.基础实验部分每个环节的预期实验结果是怎样的（结果图）？ 7.进入分子生物学实验室进行实验时有哪些注意事项？

第二部分一一实验关键环节1.本实验的目的基因是什么？多大？2.本实验用的是什么载体？如何获得？3.如何获得和检测日的基因和载体？4.如何将目的基因和载体连接起来？（构建重组DNA）5.宿主是什么？怎么将自的基因导入宿主细胞中？6.怎么检测重组DNA是否导入宿主细胞了并将其筛选出来？7.如何使的基因表达？如何检测自的基因是否表达出了蛋白？

第二部分——实验关键环节 1.本实验的 目的基因是什么？多大？ 2.本实验用的是什么载体？如何获得？ 3.如何获得和检测目的基因和载体？ 4.如何将目的基因和载体连接起来？(构建重组DNA) 5.宿主是什么？怎么将目的基因导入宿主细胞中？ 6.怎么检测重组DNA是否导入宿主细胞了并将其筛选出来？ 7.如何使目的基因表达？如何检测目的基因是否表达出了蛋白？

第三部分一一获得目的基因1.PCR扩增目的基因的原理？反应程序有哪三步？温度是多少？每一步发生的反应？2.PCR体系包括哪些成分？3.PCR产物的长度由什么决定？扩增产物中有无非的基因产物？4.引物是如何设计的？引物除了含和模板配对的序列还有什么？扩出来的基因两端是怎样的？为什么要加入上述序列？5.如何检测PCR产物并判定其分子量大小？6.PCR产物中出现非特异性条带的原因是什么？如何减少非特异性扩增？7.要获得真核生物的目的基因为什么要做RT-PCR？

第三部分——获得目的基因 1.PCR扩增目的基因的原理？反应程序有哪三步？温度是多少？每一步发 生的反应？ 2.PCR 体系包括哪些成分？ 3. PCR 产物的长度由什么决定？扩增产物中有无非目的基因产物？ 4.引物是如何设计的？引物除了含和模板配对的序列还有什么？扩出来的 基因两端是怎样的？为什么要加入上述序列？ 5.如何检测PCR产物并判定其分子量大小？ 6. PCR产物中出现非特异性条带的原因是什么？如何减少非特异性扩增？ 7.要获得真核生物的目的基因为什么要做RT-PCR？

第四部分一一关于载体1.基因工程为什么要用载体？2.表达载体和克隆载体有什么不同？实验所用载体是哪种？为什么？3.本实验所用质粒载体的结构？（质粒图谱中每部分的功能？）4.怎样培养含有质粒的宿主菌？在培养基中加入何种抗生素的依据是什么？5.如何提取质粒载体（原理）？6.提取出的质粒电泳后几条带？为什么？质粒酶切后和目的基因插入后电泳条带会有什么变化？7.如何从水溶液中沉淀出DNA分子（扩增的目的、提出的质粒、酶切后的DNA）？

第四部分——关于载体 1.基因工程为什么要用载体？ 2.表达载体和克隆载体有什么不同？实验所用载体是哪种？为什么？ 3.本实验所用质粒载体的结构？（质粒图谱中每部分的功能？） 4.怎样培养含有质粒的宿主菌？在培养基中加入何种抗生素的依据 是什么？ 5.如何提取质粒载体（原理）？ 6. 提取出的质粒电泳后几条带？为什么？质粒酶切后和目的基因插 入后电泳条带会有什么变化？ 7. 如何从水溶液中沉淀出DNA分子（扩增的目的、提出的质粒、酶 切后的DNA）？

第五部分一一DNA重组（或表达载体构建1.为了将目的基因和质粒载体构成重组DNA，进行了哪些操作？（反应体系和反应条件是怎样的？）2.用了哪两种限制酶？限制酶酶切以后目的基因和质粒的未端序列是怎样的？为什么目的基因可以用所选的两种限制酶进行酶切？3.用了哪种连接酶？这个酶有什么特点？常用的连接酶还有哪种？4.为什么用两种限制酶进行酶切？只用一种限制酶酶切后加连接酶可以将目自的基因和载体重组吗？二者有什么差别？5.酶的buffer含有什么成分？不同酶（限制酶、连接酶、tag）的buffer是否相同？用两种限制酶选用buffer时有什么要求？1oxbuffer应该如何应用？含酶的反应体系的加样顺序？6.为什么连接体系中目的基因和质粒的比例为7：1而不是1：1？如何初步判断载体是否酶切成功？目的基因和载体是否连接成功？7连接产物后续进行将什么操作？

第五部分——DNA重组（或表达载体构建） 1.为了将目的基因和质粒载体构成重组DNA，进行了哪些操作？（反应体系和反应 条件是怎样的？） 2. 用了哪两种限制酶？限制酶酶切以后目的基因和质粒的末端序列是怎样的？ 为什么目的基因可以用所选的两种限制酶进行酶切？ 3.用了哪种连接酶？这个酶有什么特点？常用的连接酶还有哪种？ 4.为什么用两种限制酶进行酶切？只用一种限制酶酶切后加连接酶可以将目的基因 和载体重组吗？二者有什么差别？ 5.酶的buffer含有什么成分？不同酶（限制酶、连接酶、taq酶）的buffer是否相同？ 用两种限制酶选用buffer时有什么要求？10xbuffer应该如何应用？含酶的反应体 系的加样顺序？ 6.为什么连接体系中目的基因和质粒的比例为7：1而不是1：1？如何初步判断载体 是否酶切成功？目的基因和载体是否连接成功？ 7.连接产物后续进行将什么操作？

第六部分一一宿主、转化1.什么是转化？本实验重组DNA转化时所用的宿主菌是什么菌株？2.为什么要诱导宿主菌的感受态？如何诱导感受态？3.热激法转化的步骤是怎样的？4.转化时设置4个对照组的目的？（教材p28表8-3）5.转化后为什么先用不含amp的LB培养基培养1h，又涂布在含amp的培养基上？含amp的LB培养基平板是如何制成的？6.转化后培养基平板上长出的菌落会有哪些类型？7转化后的平板为什么要倒置培养？

第六部分——宿主、转化 1.什么是转化？本实验重组DNA转化时所用的宿主菌是什么菌株？ 2.为什么要诱导宿主菌的感受态？如何诱导感受态？ 3.热激法转化的步骤是怎样的？ 4.转化时设置4个对照组的目的？（教材p28表8-3） 5.转化后为什么先用不含amp的LB培养基培养1h，又涂布在含amp 的培养基上？含amp的LB培养基平板是如何制成的？ 6.转化后培养基平板 上长出的菌落会有哪些类型？ 7.转化后的平板为什么要倒置培养？

第七部分一一阳性克隆的筛选鉴定1.什么是克隆？什么是阳性克隆？在含amp的LB固体培养基平板上长出的菌落都是阳性克隆吗？2.鉴定阳性克隆的方法主要有哪些？3.什么是菌体PCR鉴定？进行鉴定时模板用什么？引物用什么？4.菌体PCR鉴定时所用模板越多越好吗？5.什么是假阳性？怎样降低假阳性？6.如果转化后感受态对照管有菌落而转化实验管和阳性对照管都没有菌落说明什么？（教材p28表8-3）7.如果转化后4个管都有菌落说明什么？（教材p28表8-3）

第七部分——阳性克隆的筛选鉴定 1.什么是克隆？什么是阳性克隆？在含amp的LB固体培养基平板上 长出的菌落都是阳性克隆吗？ 2.鉴定阳性克隆的方法主要有哪些？ 3.什么是菌体PCR鉴定？进行鉴定时模板用什么？引物用什么？ 4.菌体PCR鉴定时所用模板越多越好吗？ 5.什么是假阳性？怎样降低假阳性？ 6.如果转化后感受态对照管有菌落而转化实验管和阳性对照管都没 有菌落说明什么？（教材p28表8-3） 7.如果转化后4个管都有菌落说明什么？（教材p28表8-3）

第八部分一一目的基因的诱导表达和检测鉴定1.本实验用什么方法诱导表达？为什么？2.在什么时机进行诱导？为什么选择这个时机？3.SDS-PAGE检测蛋白时分离胶和浓缩胶有什么不同？上样缓冲液的成分和作用？4.什么样的电泳结果说明目的基因表达出了目的蛋白？5.如果目的基因的（dps基因为522bp）若氨基酸的平均相对分子量为120Da，其编码的蛋白分子量大约是多少？6.如果电泳时样品不往下移动原因是什么？7.聚丙烯酰胺凝胶如何制备？有哪些注意事项？

第八部分——目的基因的诱导表达和检测鉴定 1.本实验用什么方法诱导表达？为什么？ 2.在什么时机进行诱导？为什么选择这个时机？ 3.SDS-PAGE检测蛋白时分离胶和浓缩胶有什么不同？上样缓冲液的 成分和作用？ 4.什么样的电泳结果说明目的基因表达出了目的蛋白？ 5.如果目的基因的（dps基因为522bp）若氨基酸的平均相对分子量 为120Da，其编码的蛋白分子量大约是多少？ 6.如果电泳时样品不往下移动原因是什么？ 7.聚丙烯酰胺凝胶如何制备？有哪些注意事项？