《分子生物学》课程教学课件（讲稿）第六章 真核基因表达调控（真核基因表达调控转录后水平调控）

2018/4/18RNAi 的特点RNAi生物学意义·参与基因表达转录后后水平及转录水平的基因沉默较高特异性：能够非常特异地降解与之序·保护基因组免受外源基因侵入，维持基因列相应的单个同源基因的mRNA。组稳定高效性：相对少量的dsRNA就可以使相应的基因表达受抑制。可遗传性及远距离效应：RNAi基因表达的效应可以突破细胞的界限，可传递给子代。RNAi的应用RNAi相关知识一基因沉默·研究基因的功能·基因沉默分为转录水平的基因沉默(TranscriptionalGeneSilencing，TGS）和转录后·防御病毒的感染水平的基因沉默(Post-transcriptionalGene·基因治疗Silencing,PTGS)两种：肿瘤的基因治疗·TGS是指转基因在细胞核内RNA合成受到了阻止而导致基因沉默：·PTGS则是指转基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细胞质里却无相应的mRNA存在这一现象。RNAi的作用机制RNAi的应用目前普遍认为，共抑制、基因压制和RNAi很基因治疗：RNAi作用的高度特异性有可能特异地抑制致病的突变等位基因，但又不影响正常的等位基可能具有相同的分子机制，都是通过dsRNA因。的介导而特异地降解靶mRNA，抑制相应基肿囊的基因治疗：肿瘤是多个基因相互作用的基因因的表达。即RNAi、共抑制、基因压制网络调控异常的结果，传统技术诱发的单个癌基因均属于PTGS！现已初步阐明dsRNA介导的的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi同源性靶mRNA降解过程主要分为两步。可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一序列的dsRNA分子，只导入一种dsRNA既可以产生多个基因同时沉默。1

2018/4/18 1 RNAi 的特点 转录后后水平及转录水平的基因沉默 较高特异性：能够非常特异地降解与之序 列相应的单个同源基因的mRNA。 高效性：相对少量的dsRNA就可以使相应 的基因表达受抑制。 可遗传性及远距离效应：RNAi基因表达的 效应可以突破细胞的界限，可传递给子一 代。 RNAi生物学意义 • 参与基因表达 • 保护基因组免受外源基因侵入，维持基因 组稳定 RNAi的应用 • 研究基因的功能 • 防御病毒的感染 • 基因治疗 肿瘤的基因治疗 RNAi相关知识—基因沉默 • 基因沉默分为转录水平的基因沉默 (Transcriptional Gene Silencing, TGS) 和转录后 水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing, PTGS)两种： • TGS是指转基因在细胞核内RNA 合成受到了阻 止而导致基因沉默； • PTGS 则是指转基因能够在细胞核里被稳定 地转录，但在细胞质里却无相应的mRNA 存 在这一现象。 RNAi的作用机制 目前普遍认为，共抑制、基因压制和RNAi很 可能具有相同的分子机制，都是通过dsRNA 的介导而特异地降解靶mRNA, 抑制相应基 因的表达。 即RNAi、共抑制、基因压制 均属于PTGS！现已初步阐明dsRNA介导的 同源性靶mRNA降解过程主要分为两步。 RNAi的应用 基因治疗：RNAi 作用的高度特异性有可能特异地抑 制致病的突变等位基因，但又不影响正常的等位基 因。 肿瘤的基因治疗：肿瘤是多个基因相互作用的基因 网络调控异常的结果，传统技术诱发的单个癌基因 的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi 可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性 很高的保守序列这一特性，设计针对这一序列的 dsRNA分子，只导入一种dsRNA 既可以产生多个基 因同时沉默

2018/4/18展望：研究基因的功能：由于RNAi可以特异性抑制RNAi是近年来才发现的一种古老的、保特定的基因，获得功能丧失，因此可用于功守的生物途径，是生物体适应外界环境、能基因组的研究（类似Geneknockout)。调控基因表达、防止外来遗传因子入侵的·防御病毒的感染：RNAi具有对抗侵入性遗传重要机制，具有重大的生物学意义。因子（如病毒、转座子、转基因）的作用、RNAi现已成为国内外研究的热点，随着对打破其复制循环、减弱或消除其基因毒性作RNAi机制研究的深入和RNAi技术的不断完用。由于RNAi也存在于哺乳动物细胞中，善，RNAi有望成为治疗病毒感染性疾病的RNAi或许可被利用来治疗病毒性疾病。新方法。发现五、MicroRNAs（miRNAs）：微小RNA·1993年，第一次发现线虫microRNA：lin-4，它调：概念：控线虫胚胎后期发育在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编·microRNAlin-4与lin14基因的mRNA3'UTR配对，形码RNA，其大小长约19~25个核苷瞰。成双链实现对lin14基因的转录后调控。miRNA的表达具有组织特异性和阶段特异性。即：在不·后来又发现了microRNAlet7，可以与多个发育相关同组织中表达有不同类型的miRNA,在生物发育的不同阶段基因的mRNA3'UTR互补里有不同的miRNA表达：：microRNAlin4和let7以相似的机制调控线虫发育各阶段关键基因的正确时空表达miRNA的生成：miRNA具有高度保守性：即各种miRNA都能在其他种系中找到同源体：·据体内外实验研究表明miRNA的生成至少需要两个步骤：miRNA独有的特征：其5'端第一个碱基倾向U（缺乏G），但第二到第四个碱基缺乏U，一般来讲，除第四个碱基外，其1）将长的内源性初级转录产物他位置碱基通常都缺乏C（pri-miRNA)生成7Ont左右的miRNA执行一定的生物学功能：.miRNA前体（pre-miRNA)，该过对与其互补的mRNA表达水平具有调节作用：程发生在细胞核；一些偏大的miRNA可能参与了基因组的重组装（27nt）：21-23ntmiRNA2)pre-miRNA在Dicer的作用下可被剪切为成熟miRNA，该过程发生在细胞质中。2

2018/4/18 2 • 研究基因的功能：由于RNAi 可以特异性抑制 特定的基因，获得功能丧失，因此可用于功 能基因组的研究（类似Gene knock out)。 • 防御病毒的感染：RNAi具有对抗侵入性遗传 因子（如病毒、转座子、转基因）的作用、 打破其复制循环、减弱或消除其基因毒性作 用 。由于RNAi也存在于哺乳动物细胞中， RNAi或许可被利用来治疗病毒性疾病。 展望 RNAi是近年来才发现的一种古老的、保 守的生物途径，是生物体适应外界环境、 调控基因表达、防止外来遗传因子入侵的 重要机制，具有重大的生物学意义。 RNAi现已成为国内外研究的热点，随着对 RNAi机制研究的深入和RNAi技术的不断完 善，RNAi有望成为治疗病毒感染性疾病的 新方法。 五、MicroRNAs（miRNAs）：微小RNA • 概念： 在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编 码RNA,其大小长约19~25个核苷酸。 miRNA的表达具有组织特异性和阶段特异性。即：在不 同组织中表达有不同类型的miRNA,在生物发育的不同阶段 里有不同的miRNA表达； 发现 • 1993年，第一次发现线虫microRNA：lin-4，它调 控线虫胚胎后期发育 • microRNAlin-4与lin14基因的mRNA3‘UTR配对，形 成双链实现对lin14基因的转录后调控。 • 后来又发现了microRNAlet7，可以与多个发育相关 基因的mRNA3‘UTR互补 • microRNAlin4和let7以相似的机制调控线虫发育各 阶段关键基因的正确时空表达 • miRNA具有高度保守性，即各种miRNA都能在其他种系中找 到同源体； • miRNA独有的特征：其5‘端第一个碱基倾向U（缺乏G），但 第二到第四个碱基缺乏U，一般来讲，除第四个碱基外，其 他位置碱基通常都缺乏C • miRNA执行一定的生物学功能： 对与其互补的mRNA表达水平具有调节作用； 一些偏大的miRNA可能参与了基因组的重组装（27nt）； miRNA的生成 • 据体内外实验研究表明miRNA的生成至少需要两个步骤： 1）将长的内源性初级转录产物 （pri-miRNA)生成70nt左右的 miRNA前体（pre-miRNA)，该过 程发生在细胞核; 2) pre-miRNA在 Dicer的作用下可 被剪切为成熟miRNA，该过程发生 在细胞质中

2018/4/18大多教miRNA与能物mRNA不亮全配对结合，它们并不改变miRNA的稳定性，而是通过抑制翻评来使基因沉默.miRNA与靶mRNA的作用模式：xo0000001）二者不完全互补，即不完全时配对结合时，主要影响翻8Q5译过程面对mRNA的稳定性无任何影响。如线虫的lin-42）二者完全互补，即完全配对结合后，类似siRNA与靶mRNA的结合，特异性的切割mRNA。如miR39/miR1713）上述两种模式均具备。当其与靶mRNA完全互补配对时，直接靶向切割mRNA，而不完全互补配对时起调节基因翻译的作用。如let-7果蝇/线虫celORNAmiRNA与siRNA的作用机制NuCytopniRNAPmiRNA与siRNA的联系：·均为Dicer的产物：/长度均为22nt左右·功能：5'端是磷酸基研究表明miRNA参与各种各样的调节途径，包3°端是羟基括发育、病毒防御、造血过程、器言形成、细胞增殖和测亡、脂肪代谢等等。均需Argonaute家族蛋白的存在沉默机制有重叠同为RISC的组分二者进化关系上可能的两种推论：siRNA是miRNA的补充miRNA在进化过程中替代了siRNA3

2018/4/18 3 miRNA与靶mRNA的作用模式： 1）二者不完全互补，即不完全时配对结合时，主要影响翻 译过程而对mRNA的稳定性无任何影响。如线虫的lin-4 2）二者完全互补，即完全配对结合后，类似siRNA与靶 mRNA的结合，特异性的切割mRNA。如miR39/miR171 3）上述两种模式均具备。当其与靶mRNA完全互补配对时， 直接靶向切割mRNA，而不完全互补配对时起调节基因翻 译的作用。如let-7 果蝇/线虫 大多数miRNA与底物mRNA不完全配对结合，它们并不改变 miRNA的稳定性，而是通过抑制翻译来使基因沉默。 miRNA与siRNA 的作用机制 • 功能： 研究表明miRNA参与各种各样的调节途径，包 括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞 增殖和凋亡、脂肪代谢等等。 miRNA与siRNA的联系： • 均为Dicer的产物：长度均为22nt左右 5＇端是磷酸基 3＇端是羟基 • 均需Argonaute家族蛋白的存在 同为RISC的组分 • 二者进化关系上可能的两种推论： siRNA是miRNA的补充 miRNA在进化过程中替代了siRNA 沉默机制有重叠

2018/4/18寻找miRNA的方法：分子信息学筛选miRNA的原理：·该方法的出发点为前体的发夹状结构及miRNA在A分子生物学的方法物种间的保守性。B分子信息学的方法：·miRNA基因可能定位于编码蛋白基因的内含子区域（有意义链或反义链）及远离任何已知基因的基因间区域。应用计算机的方法如MirScan来寻找miRNA分子已经在线虫及脊椎动物体内取得了一些时候，几个发夹状结构以多顺反子的形式丛集在一起巨大的成功。美因品理的全出学基然样高学RNA2004年6月，吴政道在前述的计算机方法基因的准确性的1上游和下游售的基础上提出一种可以进行高通量筛选miRNA的数量：2）候选发夹状结构的上游高度保守的模序的存在。靶位点的方法小结寻找miRNA作用的靶mRNA的方法：A分子信息学的手段：·RNA不再只是作为DNA与蛋白质之间的中介发挥作MIT的BartelandChrisBurge报道了一种可以用来探测用，而是参与到了基因的表达调控、RNA的定点miRNA与其作用的靶基因之间的关系的新的计算机的方修饰，以及染色体的结构组织等各个方面。法一一TatgetScan。他们针对已知的每一个miRNA，扫描mRNA的数据库一—DNA转译为蛋白的生化信息，搜索与·短短几年内小分子RNA研究的迅速突破，为人们miRNA匹配的片段，然后对miRNA与mRNA的匹配程度评分，提供了一种全新的认识基因和基因表达调节本质推测在三个或以上物种中获得高分的mRNA为该miRNA的的角度，同时也使人们开始注意小分子RNA在疾靶基因。病发生过程中所扮演角色。B分子生物学方法4

2018/4/18 4 寻找miRNA的方法： A 分子生物学的方法 B 分子信息学的方法： 应用计算机的方法如MirScan来寻找 miRNA分子已经在线虫及脊椎动物体内取得了 巨大的成功。 2004年6月，吳政道在前述的计算机方法 的基础上提出一种可以进行高通量筛选miRNA 靶位点的方法 分子信息学筛选miRNA的原理： • 该方法的出发点为前体的发夹状结构及miRNA在 物种间的保守性。 • miRNA基因可能定位于编码蛋白基因的内含子区域（有意 义链或反义链）及远离任何已知基因的基因间区域。 • 一些时候，几个发夹状结构以多顺反子的形式丛集在一起. • Uwe Ohler, Chris Burge等人给出了一些可以提高寻找miRNA 基因的准确性的一些附加条件：1）上游和下游保守序列 的数量；2）候选发夹状结构的上游高度保守的模序的存 在。 寻找miRNA作用的靶mRNA的方法： A 分子信息学的手段： MIT的Bartel and Chris Burge报道了一种可以用来探测 miRNA与其作用的靶基因之间的关系的新的计算机的方 法——TatgetScan。他们针对已知的每一个miRNA，扫描 mRNA的数据库——DNA转译为蛋白的生化信息，搜索与 miRNA匹配的片段，然后对miRNA与mRNA的匹配程度评分， 推测在三个或以上物种中获得高分的mRNA为该miRNA的 靶基因。 B 分子生物学方法 小结 • RNA不再只是作为DNA与蛋白质之间的中介发挥作 用，而是参与到了基因的表达调控、RNA的定点 修饰，以及染色体的结构组织等各个方面。 • 短短几年内小分子RNA研究的迅速突破，为人们 提供了一种全新的认识基因和基因表达调节本质 的角度，同时也使人们开始注意小分子RNA在疾 病发生过程中所扮演角色