《分子生物学》课程教学课件（讲稿）第二章 染色体与DNA（C0t曲线）

2018/3/20、DNA分子的变性DNA的变性、复性与Cot曲线1、变性（denaturation 或融解melting）：DNA双娠旋区的氢链断裂，使双爆旋的两条链完全分开变成单链，这一链分高的过程叫做变性条件：加热，板端pH，有机落剂（尿素、酰胺），低盐浓度等udI熔解曲线与Tm值炎熔液黏度降低米沉降速度加大OD※浮力密度上升1.37蒸此外吸收值升高（A260nm），即增色效应指在DNA变性的过程中，他在260mm的吸收值先是缓慢1.185上升，达到某一温度时及骤然上升天然DNA和更性DNA的吸收值相差可达34%1.0eTm-ofC-C.2-OD增加值的中点温度(一般为85-95°C)或DNA双爆旋结构失去一半时的温度速电是一般PCR实验技术中記支性温度定为94℃的原固常用的变性方法2、二、DNA分子的复性（annealorrenaturation）★热变性概念：变性DNA在适当条件下，两条被此分开的链又可以重新地合成双螺旋结构的过程（退火）应用广泛，特别是用于变性动力学研究Denaturation缺点：高温引起碑晚二略做的新联，得到长级不一的单缺S.SDNAD.SDNA☆碱变性VRenaturationpH11.3时，全部氢键被淘汰无热变性的缺点，为制务单键DNA的首选方法O保存单链DNA的条件保持pH大于11.3盐浓度低于0.01mo1/复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞1

2018/3/20 1 DNA的变性、复性与Cot曲线 一、DNA分子的变性 1、变性（denaturation 或融解 melting）： DNA双螺旋区的氢键断裂，使双螺旋的两条链完全分开变 成单链，这一链分离的过程叫做变性 条件：加热, 极端pH, 有机溶剂（ 尿素、 酰胺 )，低盐浓度等 ※ 熔液黏度降低 ※ 沉降速度加大 ※ 浮力密度上升 ※ 此外吸收值升高（A260nm），即增色效应 指在DNA变性的过程中，他在260nm的吸收值先是缓慢 上升，达到某一温度时及骤然上升 天然DNA和变性DNA的吸收值相差可达34％ 1.185 1.0 1.37 OD ℃ Tm = ℃ of Ct = C0/2 = OD增加值的中点温度(一般为85-95℃) 或DNA双螺旋结构失去一半时的温度 熔解曲线与Tm值 这也是一般PCR实验技术中把变性温度定为94 ℃的原因 2、 常用的变性方法 ☆ 热变性 ☆ 碱变性 应用广泛，特别是用于变性动力学研究 缺点：高温引起磷酸二酯键的断裂，得到长短不一的单链 pH11.3时，全部氢键被淘汰 无热变性的缺点，为制备单链DNA的首选方法 ◎ 保存单链DNA的条件 保持pH大于11.3 盐浓度低于0.01mol/L D.S DNA S.S DNA Denaturation ▲ ▼ Renaturation 复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞 二、DNA分子的复性 （anneal or renaturation） 概念：变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的链又可以 重新地合成双螺旋结构的过程（退火）

2018/3/201、影响DNA复性过程的因素3′-ATCTATGCTGTCAT-5'阳高子浓度3'-ATCTATGCTGTCAT-5'0.18~0.2MNa+可消除静电斥力5°-TAGATACGACAGTA-35-TAGATACGACAGTA-3复性反应的温度低于Tm值25°C左右（60-65°C）3'-ATATATATATAT-5→S.S,DNA的初始浓度C5-TATATATATATA-33'-ATATATATATAT-5*S.S.DNA分子的长度（片段的大小）3'-ATATATATATAT-5'S.S.DNA愈长一分子扩散愈慢→复性愈慢5-TATATATATATA-3*S.S.DNA愈短一→分子扩散愈快→复性愈快5-TATATATATATA-3"3'-ATATATATATAT-5*DNA分子中，dNt的排列状况（随机排列，重复排列）5*-TATATATATATA-3中二、Ct曲线一一复性动力学曲线dC,/d,=-KC2积分单链DNA的随机磁撞过程（randomlycollision）Ct/C是Cgt的函数C,/C-1/(1+KC,t）接此公式作图得Ct曲线遵循二级反应动力学当C/C-1/2时反应初始t=0C,/C,-1/2-1/(1+KCst(un)单链DNA浓度-Cac./d,--kca反应达时K-1/Ctun)Ct（1/2）值对DNA具有特-单链DNA浓度-C征性，其中与DNA的碱基K一复性速度常数对数目成反相关Cta,=1/K(mol.Sec/L)常数Fraction reassociatec复杂性35001.7×104.2×10b1-Ct/CoC/C,因此一*COt曲线提供100了一种测定DNApoyu poya 分子量的方法*同时也能解Coltun)Calun)释单一来源的在控制反应条件相同的前提下，两种DNA分子的C.tn,值，DNA所具有的不取决于dNt的排列复杂性同复杂性部分（复性动力学的复杂性，Kineticcomplexity，K.CX)Catum)=2X10-6AAAAAAAAK.C.=110102101010#100%101ATCGATCGATCGK.C.-48×1093×10/9Cot.2×10K.C.-5X105 Clun)-12

2018/3/20 2 1、 影响DNA复性过程的因素 ：  阳离子浓度 0.18 ~ 0.2M Na+ 可消除静电斥力  复性反应的温度 低于Tm值 25℃左右 (60-65℃)  S.S, DNA 的初始浓度 C0  DNA 分子中, dNt 的排列状况 (随机排列, 重复排列)  S.S. DNA分子的长度（片段的大小） S.S. DNA愈长 S.S. DNA愈短 → 分子扩散愈慢 → 复性愈慢 → 分子扩散愈快 → 复性愈快 3’-ATCTATGCTGTCAT-5’ 5‘-TAGATACGACAGTA-3’ 5‘-TAGATACGACAGTA-3’ 3’-ATCTATGCTGTCAT-5’ 3’-ATATATATATAT-5’ 5‘-TATATATATATA-3’ 3’-ATATATATATAT-5’ 5‘-TATATATATATA-3’ 5‘-TATATATATATA-3’ 3’-ATATATATATAT-5’ 3’-ATATATATATAT-5’ 5‘-TATATATATATA-3’ 二、C0t曲线－－复性动力学曲线  遵循二级反应动力学 dCt / dt = -KC0 2 反应初始 t = 0  单链DNA的随机碰撞 过程（ randomly collision ） 单链 DNA浓度 = C0 反应达 t 时 单链DNA浓度 = Ct K＝复性速度常数 dCt / dt = -KC0 2 积分 Ct / C0 = 1 / (1+KC0t ) 当 Ct / C0 = 1/2 时 Ct / C0 = 1/2 = 1 / (1+ KC0t (1/2)) K = 1 / Cot (1/2) Cot (1/2) = 1/K (mol. Sec / L) 常数 Ct/C0是C0 t的函数 按此公式作图得C0 t曲线 C0 t(1/2)值对DNA具有特 征性，其中与DNA的碱基 对数目成反相关 在控制反应条件相同的前提下, 两种DNA分子的C0t (1/2)值, 取决于dNt 的排列复杂性 ( 复性动力学的复杂性, Kinetic complexity, K.C X ) AAAAAAAA K. C. = 1 C0t (1/2) = 2×10-6 ATCGATCGATCG K.C. = 4 K.C. = 5 ×105 C0t (1/2) = 1 Ct/C0 0 1 0 1 C0 t (1/2) C0 t (1/2) Fraction reassociated 1－Ct／Co 因此－－ * C0t曲线提供 了一种测定DNA 分子量的方法 * 同时也能解 释单一来源的 DNA所具有的不 同复杂性部分 复杂性

2018/3/20Rd(1-ce)自主学习指导1.原核生物和真核生物的拓扑异构酶的类型及其功能？2.怎样用复性动力学曲线测定DNA序列的复杂1性？icndO1P74图-1660x150x1CCamoledybp3403

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