《分子生物学》课程教学课件（讲稿）第二章 染色体与DNA（DNA复制）

2020-3-10第三章DNA复制和修复想一想(DNA Replication and Repair)怎样书写DNA链，怎么区分上游和下游？Sidevk想一想第一节DNA复制的概貌DNA复制不能从头开始，必需有引物！DNA在什么时候进行复制？（原核、真核）一、半保留性怎样证明DNA复制是半保留、半不连续和双向复二、半不连续性制三、复制的原点四、复制的方向五、复制的方式DNA复制在细胞周期的S期一、半保留性1958Meselson-stahl设计的15N标记、CsCl起高心实验mammaliancel细胞生长在15N标记培养基中转入正常N源培养基中分离各代DNA..500-5000bp/mir分析各代DNA的浮力密度DNA:HH-HL→LLE.coli 37 ~CsCI密度梯度离心浮力密度0.5 hN15-DNA1.742g/mlN15-N14-DNA1.717g/ml105bp/minN14-DNA1.710g/ml

2020-3-10 1  怎样书写DNA链，怎么区分上游和下游？ 想一想 第三章 DNA复制和修复 (DNA Replication and Repair) 第一节 DNA复制的概貌 DNA复制不能从头开始，必需有引物！ 一、半保留性 二、半不连续性 三、复制的原点 四、复制的方向 五、复制的方式 想一想  DNA在什么时候进行复制？（原核、真核）  怎样证明DNA复制是半保留、半不连续和双向复 制？ DNA 复制在细胞周期的S期 E.coli 37 ℃ 0.5 h 105 bp/min mammalian cell 500-5000 bp/min  1958 Meselson-stahl 设计的15N 标记、CsCl超离心实验 · 细胞生长在15N 标记培养基中 · 转入正常N源培养基中 · 分离各代DNA · 分析各代DNA的浮力密度 DNA: HH→HL → LL CsCl密度梯度离心 浮力密度 N15－DNA 1.742g/ml N15－N14－DNA 1.717g/ml N14－DNA 1.710g/ml 一、半保留性

2020-3-100复制叉（Replicationfork）：染色体中参与复制的Hybrd活性区域，即复制正在发生的位点复制眼（replicationeye）：电子显微镜下观察正Lght在复制的DNA，复制的区域形如一只眼睛RecaeinLLLHHHmediumUght复制子：从同一复制原点复制的一段DNA序列。ybrDNAReplicationBubble5、半不连续性复制的起始与终止位点有什么特点？DNA三、复制的原点LeadingStrandLagging Strand·富含AT&发夹结构Leading Strand许多酶的结合位点LaggingStra·原核生物：单个真核生物：多个HNA POHIDNAPOHDNA真核生物的多复制子 多个复制眠Orqin1OriqinzAppearanceofeReplicating estructurestructure by electronMeasure ayerage replicon lengthmioscopyAREPLICATION EYEFORMSATHETA1SEOECOSSTRUCTURE IN CIRCULAR DNA.2

2020-3-10 2 15N 标记 DNA 复制叉（Replication fork）：染色体中参与复制的 活性区域，即复制正在发生的位点 复制眼（replication eye）：电子显微镜下观察正 在复制的DNA，复制的区域形如一只眼睛 复制子：从同一复制原点复制的一段DNA序列。 三、复制的原点 •富含AT & 发夹结构 许多酶的结合位点 •原核生物：单个 •真核生物：多个 复制的起始与终止位点有什么特点？ 真核生物的多复制子 多个复制眼

2020-3-10单起点、单方向四、复制方向（原核）单向复制双向复制多起点、单方向(真核)BIDIRECTIONAL REPLICATIONUNIDIREOTIONALREPLCATION单起点、双方向（原核）ReplicationforkReplicationfoReplicationfu多起点、双方向（真Y核)VVARepicatedDNAParenta DN一个复制叉两个复制叉五、复制的方式线性DNA：复制叉式（需特殊机制解决末端问题，否则DNA逐渐编短）环形DNA：复制叉式（0-复制）滚环复制（o-复制）置换式复制（D-环型）线性DNA：复制叉式0-复制Origin1Oriqin2AAppearanceofeReplicating structureMeasure averagerepicon lengtnstructure by electronmioscopyA REPLICATION EYE FORMS ATHETAusedrepliconSTRUCTURE IN CIRCULAR DNA.3

2020-3-10 3 单向复制 双向复制 四、复制方向 一个复制叉 两个复制叉 单起点、单方向 （原核） 多起点、单方向 （真核） 单起点、双方向（原核） 多起点、双方向（真 核） 五、复制的方式 线性DNA： 复制叉式（需特殊机制解决末端问题，否则 DNA逐渐缩短） 环形DNA： 复制叉式（θ-复制） 滚环复制（σ-复制） 置换式复制（D-环型） 线性DNA： 复制叉式 θ-复制

2020-3-10TemnpiateiscircuiarcupiexDNaNAPlICn滚环式复制（rollingccursononestrandedcircle replication)置换式ecshaponowacpenNickatortain(DisplacementDloopepandsClongaton.gf growing strandform)由于复制时产生的滚srowing strandced etrandclis环结构形状象6，又称OriainonOisplacedstrand2Gneyouindiplacedstrandreache复制PHSTaupiexccl线粒体和叶绿体CgptineedseiandationdenerateitiengtrsDNA的复制方式病毒、细菌因子0asn表3-4E.coli的复制基因类变体的表型功能或基因的产物基第二节 原核生物DNA复制duadE.cali复制起始：分子量52KDa亲集于aricdnaB链延长，引发体的组分，六案体，分子量300KD，每细胞20个分子，具有螺策胖活性drucC复制起始和前体片断合成的起始，引发体组分分子量25KDa，六个单体结合于DnaB大肠杆菌DNA的复制过程：六豪体，deD其实就是dnaC，符号dnaD不再使用，draEpol的核心蛋白；具有象合和校对功能、分子蛋132KDa,每细胞20 个分子。起始核糖核苷酸还原酶，又称mdA1Ce引发酶，合成前体片断的引物，单体，分子量60KDe，每组胞75个分子与dnaA类似、延伸还未很好地鉴定，dnohdeal链的廷长、细节不明。终止三、deaK复制起始。细节不明、与累鲲的HSP70有相关性。SdeaN链的延长，Pol全酶的亚基β、分子量37KDa，drap复制起始、细节不明；PolI全酶的亚基，druQF复制的保真度，PolI的全降的至基t，分子量27KDa，deazxF编码71KDa的亚基r，亚基能与模板结合：亚基r在蛋白水解酶作用下生成52KDa的亚基以构成√复合体。长245bpE.coli复制的原点oricdnarF118bp,产物是稀有的tRNAn13bp重复：PolA多功能的Pal 1、随的延长：前体片新连接，S,FDNA 美转酶的亚基、能引人负超螺族，能消除正超螺旋、可为啶酮酸所摔制,RyrA9bp重复：DnaA结合位点ErBS,FDNA美转醇的β亚基、能为香豆带素所抑制.★三个13bp的直复序列4bigDNA连接酶、封合奶刻、连接前体片断，分子量75KDs，每细脑300个分子，BincEtErEsApmendutdUTPasetmarmguyrepF螺旋酶，在复制叉处解开DNA双螺族，带水解ATP，分子量66KDe，每细陷50个分子。GATCTNTTNTTT+四个9bp的蓝复序列Mng尿噻啶-N-糖基酶，从DNA上除去尿噻啶。EEDnaA结合位点PoA,B,C.DRNA聚合酶亚基，复起始，某些体系中合成引物hu[GATCTSYTIATIBATCTNTNTATTGATCTCTIATFAS刺激依赖oriC的DNA复制sbTGTGIATAAF单链DNA结合蛋白，能防止链间或链内形成氢键，复制又的前进，引发过程，链的延48bg长都不能缺少，四案体，分子量74KD，每细胞有300个分子。ITATACACAI1ITGGATAACTTATCCACA(daT)F预引发体及引发体组分，1分子~2分子/复制叉，三聚体，分子量66KDs，每细陷50个分子pdF预引发体及引发体组分。1分子/复制又、分子量55KDa，每细胞有80个分子若干GATC位点C预引发体及引发伴组分。RF预引发体及引发伴组分，4

2020-3-10 4 滚环式复制（rolling circle replication） 由于复制时产生的滚 环结构形状象σ，又称σ 复制 病毒、细菌因子 置换式 （Displacement form ） 线粒体和叶绿体 DNA的复制方式 第二节 原核生物DNA复制 大肠杆菌DNA的复制过程： 一、 起始 二、 延伸 三、 终止 E.coli 复制的原点oriC ♦ 四个9bp的重复序列 DnaA结合位点 ♦ 三个13bp的 重复序列 若干GATC位点 长245bp 13bp重复： 9bp重复：DnaA结合位点

2020-3-10①DnaA蛋白结合oriC，复制起始：②DNA双链局部被打开（需HU蛋白表5-7引物体的组成协助及ATP)辨认起始点亚基质量（kD）蛋白亚基结构③DnaC蛋白及DnaB蛋白结合于起形成单链始点，DnaB蛋白具有解螺旋作用合成引发体76单体PriA(n')合成引物④其他蛋白及引物酶加入，形成引11.5二聚体PriB(n)发体单体23PriC(n")50naADnaB六聚体in29单体DnaC60单体引物酶（DnaG)n.n.n为各该蛋白原来的表示法。冷*引发体组装及引物合成二、复制的延伸复制起点处DnaA识别并结合进入的标志：DNApolII把第一个核苷酸加到引物的3'一OH端一DnaB·DnaC等六聚体形成预引发体（1）复制方向：一个起点双向复制。→复制起点处双链打开(2）链的延长：半不连续复制一DnaG（引物酶）加入形成引发体前导链后随链：第一个风崎片段起始于先导链进入延伸一→引发体中的引物酶合成RNA引物之后。冈崎片段1000～2000NT*DNApolIⅢI等酶结合，完成复制体组装、合复制速度：50,000bp/min成DNA1.大肠杆菌DNA聚合酶DNA的复制延伸用到哪些酶和蛋白质？DNAplolDNAplolDNAplollII引发酶（引物酶）15'>3'聚合酶活性+DNA聚合酶（酶I和酶I）2需要模板、引物5'>3'外切酶活性+DNA解螺旋酶3.-（有条件）单链结合蛋白（SSB)3'>5'外切酶活性x+拓扑异构酶（旋转酶）5校对功能DNA连接酶(proofreading)n.功能修补引物区、DNA损伤DNA复制核糖核酸酶H(RNaseH)7.DNA损伤修修复复5

2020-3-10 5 SSB DnaA 13bp repeats 涉及转录激 活 一、复制起始： 辨认起始点 形成单链 合成引发体 合成引物 ①DnaA蛋白结合oriC， ②DNA双链局部被打开（需HU蛋白 协助及ATP） ③DnaC蛋白及DnaB蛋白结合于起 始点，DnaB蛋白具有解螺旋作用 ④其他蛋白及引物酶加入，形成引 发体 * 引发体组装及引物合成 复制起点处DnaA 识别并结合 →DnaB·DnaC等六聚体形成预引发体 → 复制起点处双链打开 → DnaG（引物酶）加入形成引发体 →引发体中的引物酶合成RNA引物 * DNApol III 等酶结合，完成复制体组装、合 成DNA 二、复制的延伸 进入的标志：DNApol Ш把第一个核苷酸加到 引物的3’－OH端 （1） 复制方向：一个起点双向复制。 （2） 链的延长： 半不连续复制 前导链 后随链：第一个冈崎片段起始于先导链进入延伸 之后。冈崎片段1000～2000NT 复制速度： 50,000bp/min 1. 引发酶（引物酶） 2. DNA聚合酶（酶III和酶I) 3. DNA解螺旋酶 4. 单链结合蛋白（SSB) 5. 拓扑异构酶（旋转酶） 6. DNA连接酶 7. 核糖核酸酶H (RNase H) DNAploI DNAploI I DNAploIII 5’→3’聚合酶活性 需要模板、引物 + + + 5’→3’外切酶活性 （有条件） + - - 3’→5’外切酶活性 校对功能 (proofreading) + + + 功能 修补引物区、 DNA损伤修 复 DNA损伤 修复 DNA复制

2020-3-10Figure13.3Nick translationreplacespartofapreDNApoll的5-3外切活性existing strandofduplexDNAwithnewtysynihesizedmaterial有以下三个特点：必须有5一磷酸末端被除去的核苷酸必须是已Nickgenerates3-OH,5-Pgrou经配对的OHPS被除去的可以是脱氧核糖核苷酸，或核糖核苷酸DNAsyntheextends3end(B) 3'→5'exonuclease activityold strand is degraded（切刻平移）8ncorrectnucieotide1957年，科恩伯格（ArthurKornberg）分离纯化DNAPOLI和DNAPOLⅢ的结构了DNA聚合酶I，又称“科恩伯格酶”，Pol I为单体酶1970年，丹麦克莱诺夫（H.Klenow）用枯草杆菌蛋白酶切割大肠杆菌DNA聚合酶I，电泳获得大小COOH两个片段。大片段保留了聚合酶和3→5外切酶活外切膜外切性，但丧失了5'一3'外切酶活性，被称为“Klenow"，又称“Klenow酶”。切口（放大）结构域Pol3'5'5-3外切酶521517324928AA断片大小图5-11Pol1的结构域DNApolIⅢI全酶有十种共22个亚基表3-2DNA豪合腹耳全醇的亚基及亚素集体基烟质量（KDe）功能及组成的亚聚集体亚dnaE132聚合牌PolI核心校对功能e力273-5外切醇Pol1醇165KD410KDaMRRO核心牌相互连接（待证明）dnazx71将核心酶与模板结合，ATPase活性draz(x）s2家Poll.组成丫复合800KDa35组成复合体，又称因子|过去误认为dnar产物33组成复合体15“组城了复合体X烟成复合体d12draN5β二豪体一一滑动钳使全牌具有选行性6

2020-3-10 6 DNApolⅠ的5’－3’外切活性 有以下三个特点： 必须有5’－磷酸末端 被除去的核苷酸必须是已 经配对的 被除去的可以是脱氧核糖 核苷酸，或核糖核苷酸 （切刻平移） PolⅠ为单体酶 34  1957年，科恩伯格（Arthur Kornberg）分离纯化 了DNA聚合酶Ⅰ，又称“科恩伯格酶”。  1970年，丹麦克莱诺夫（H. Klenow）用枯草杆菌 蛋白酶切割大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，电泳获得大小 两个片段。大片段保留了聚合酶和3’→5’外切酶活 性，但丧失了5’ →3’ 外切酶活性，被称为 “Klenow”，又称“Klenow酶”。 DNApol Ⅲ 全酶有十种共22个亚基 β二聚体 －－滑动钳

2020-3-10DNA连接酶HalicaeDnaB 5- helicaae(5-3)300kDhaxamarATPFigure13.9DNA lgase seals nicks betweenolidesbyemploying an erzyme-AMPdjaontr5OPCSSB single-strand bindngprotein 74kD tetramer60fiond+AT下超信方+NAD业DNA施转阶LO?其他引发体成分DNA螺旋萨8核糖核酸酶H(RNaseH)：！DneB-DnaCssb蛋白②特异性地催化DNA-RNA杂合体的RNA降解，3引发酶产生不同链长带3'OH和5"P末端的寡核糖核酸。物RNA该酶不能消化单链或双链DNA。DNA集合陶正全顾DNA聚合酶I?DNA连接摩4先导链后随链1.引发酶primase）dnaG编码是一种RNA亲合醇，在复制的起始点处以DNA为模板，催化合成一小段互补的RNA。需要引发体。一分子的DNApoIIII.协同合成前导链和后随链2.DNA聚合酶（DNApolymerase）：将脱氧核苷三磷酸酸案合为新的核酸长链。需要引物和模板。Leading strandDNApolymeraseIII（聚合和校对活性）：完成先导链和冈崎片段的合成Ill dimerC醇！（聚合和校对活性、5-3外切活性）：填补冈情片段间的缺口Helicases3.解螺旋醇（helicase）：又称解旋酵。大肠杆菌的解螺旋醇为DnaB。4.单链结合蛋白（SSBsingle-strand binding protein），结合并保护模x板不受核酸降的降解Inn5.拓扑异构酶（topoisomerase）：原核生物拓扑异构酶II（旋转酶(DNAgyrase)OC.gyrase）松驰正超、产生负超。拓扑异构酶I（u蛋白）松驰负超，6.DNA连接（ligase），连按双链中的单链缺口，使3-OH末端和5-PLagging strandPrimo末端形成3'5磷酸二酯链。RNApri7.核糖核酸酶H（RNaseH）切除RNA引物7

2020-3-10 7 DNA连接酶 核糖核酸酶H (RNase H)： 特异性地催化DNA-RNA杂合体的RNA降解， 产生不同链长带3'OH和5'P末端的寡核糖核酸。 该酶不能消化单链或双链DNA。 1.引发酶（primase ）： dnaG编码，是一种RNA聚合酶，在复制的起始点 处以DNA为模板，催化合成一小段互补的RNA。 需要引发体。 2.DNA聚合酶(DNA polymerase）：将脱氧核苷三磷酸酸聚合为新的核酸 长链。需要引物和模板。 酶III （聚合和校对活性）：完成先导链和冈崎片段的合成 酶I（聚合和校对活性、5'-3'外切活性）：填补冈崎片段间的缺口 3.解螺旋酶 （helicase）:又称解旋酶。大肠杆菌的解螺旋酶为DnaB。 4.单链结合蛋白（SSB single-strand binding protein），结合并保护模 板不受核酸酶的降解 5.拓扑异构酶 （topoisomerase） ：原核生物拓扑异构酶II（旋转酶 gyrase )松弛正超、产生负超。拓扑异构酶I（ ω蛋白）松弛负超， 6. DNA连接酶（ ligase）：连接双链中的单链缺口，使3’-OH末端和5’-P 末端形成3’,5’磷酸二酯键。 7. 核糖核酸酶H (RNase H) ：切除RNA引物 一分子的 DNA pol III. 协同合成前导链和后随链

2020-3-10nitstionotOesaskitagnerReascociationofocianpDHANPE2N引物图5-24复制更处前导铸和后随钱同时复制的工作模型为什么复制叉1和2的终点交叉？三、复制的终止复制叉21.终止位点序列Ter：22个碱基ri2.专一性终止蛋白Tus（terminusutilization配酸Fcoli烟substance) :terETus蛋白单体染色体lerD通过抑制DNA解螺旋酶(DnaB)而发挥终止作用复制叉1终点terAtor复制叉1terB3.两个复制又的汇合点就是复制的终点terp复制叉2终点图4-20大肠杆菌复制终止区域的结构·现已发现有两个终止区域terEDA和terCBF)DNAaccessibleDNAblocked位于相遇点的另一侧100KbReplicationproceedsReplicationterminatesP处，每一终止顺序对某一方fos向移动的复制叉来说是特异的TUS：终止需要Tus(36kD)Tus能识别ter保守顺序，DNA blockedReniainpicesDnaBeplicationterminates并阻止复制叉继续前进terTus复合物可能通过MVDnal抑制螺旋酶来实行终止8

2020-3-10 8 三、复制的终止 1.终止位点序列Ter ：22个碱基 2.专一性终止蛋白 Tus (terminus utilization substance） : 通过抑制DNA解螺旋酶(DnaB)而发挥终止作用 3.两个复制叉的汇合点就是复制的终点 推断： 不同复制叉 的tus蛋白结 合在不同的 模板连上起 作用？ 为什么复制叉1和2 的终点交叉？ ter

2020-3-10E.coliDNA合成的终止E.coli细胞加倍时间与复制起始加倍时间拓扑异构酶IVO37℃<20min~10h复制时间：40min左右588Origin of（850核苷酸/秒）repication分裂过程中其它事件约需20min（组分、隔膜）因此一一加倍时间少于60minThetwo newly synthesized circular chromosomal DNAsare的细胞两轮复制有共用时间topologicallyinterlinked(catenated)andisfinallyseparatedbytheactionof aTypeIItopoisomerases最后还有50-100bp通过修复方式填补BrernyateditdOngins or每个细胞周期复制一次可能Creplicating chromosomesattached tomembrane受OriC甲基化的控制ERASDam.methyaseDaunter cromosamneGATC11 copies inOriC细菌(E.coli)DNA每个细胞周BA1S期只复制一次O1OSeptumgrows Active ongrheenchromosomesGATCNNNNNNNMembraneTAGNNNNNNNeaeannReplicationMCOOinactiveSeptum dvdes celloriginsMTCNNNNNNNNAGNNNNNNONAIemethhaDammetyiasChromosomesOOcdistrioutedtocaughter cellsPEONENEED-DnaAbindsto orActive ongr1.多个起点，双向复制第三节真核生物DNA的复制ARS:自主复制序列,酵母等的复制原点，150bp富含ATORC:起始点识别复合物，六聚体，结合在ARS(DNA replication in Eukaryote)复制子：相对较小(13-900kb)，l.多复制子（multiplereplicon）复制速度：较慢大约500~5000bp/min复制终止通过复制又的相遇而终止冈崎片段：较短100～200NT2.5种DNA聚合酶2、真核生物的DNA聚合酶3.端粒复制常见：α、β、、、五种9

2020-3-10 9 E.coli细胞加倍时间与复制起始 加倍时间 37℃ < 20min～10h 复制时间：40min左右 （850核苷酸／秒） 分裂过程中其它事件约需 20min（组分、隔膜） 因此－－加倍时间少于60min 的细胞两轮复制有共用时间 细菌(E.coli)DNA每个细胞周 期只复制一次 每个细胞周期复制一次可能 受OriC甲基化的控制 GATC 11 copies in OriC 第三节 真核生物DNA的复制 (DNA replication in Eukaryote) 1. 多复制子（multiple replicon ）， 复制终止通过复制叉的相遇而终止 2. 5种DNA聚合酶 3. 端粒复制 1. 多个起点，双向复制 ARS:自主复制序列,酵母等的复制原点，150bp富含AT ORC:起始点识别复合物，六聚体，结合在ARS 复制子：相对较小(13-900kb), 复制速度：较慢，大 约 500~5000bp/min 冈崎片段： 较短， 100～200NT 2、真核生物的DNA聚合酶 常见： α、β、δ、ε、γ五种

2020-3-10想一想3、端粒的复制：端粒（telomere)：指真核生物染色体线性DNA福分子末端的结构。L钱性DNA复完成后，子代DNA分子哪条链的暖一端会缩短？●功能·维持染色体的稳定性2.环状DNA的复制存在这样的间题吗？·保证染色体末端DNA复制的完整性学森馨2009诺贝尔生理学或医学奖2009年生理学威医学奖：三位真国科学家伊雨莎白一布赖克本（ElizabethH.Blackburn）、卡罗尔一格需糖（CarolW.Greider）和杰克一绍斯塔克（JackW.Szostak)研究主题是“染色体如何受到端粒和端粒醇的保t三位美国科学家伊丽莎白·市兰克波恩、卡罗尔·格雷德以及杰克·绍斯塔克共同获得该奖项。他们发现了由染色体根冠制造的端粒酶(telomerase），这种染色体的自然脱落物将引发衰老和癌症内在模板RNA喝粒幕DNA端粒酶的端粒酶（Telomerase）催化机制逆转录，延长母链逆转录酶?a.核糖核蛋白（ribonucleoproteinRNP）爬b.含约长150NT的RNA，其中含1～5拷贝的CxAy重复序行模列，是合成端粒T,G,序列的模板型ACCOCN为什么端粒酶是一种逆转录酶？10

2020-3-10 10 3‘-OH 1.线性DNA复制完成后，子代DNA分子哪条链的哪一端会缩短？ 2.环状DNA的复制存在这样的问题吗？ 想一想 u 端粒(telomere)：指真核生物染色体线性DNA 分子末端的结构。 u 功能 • 维持染色体的稳定性 • 保证染色体末端DNA复制的完整性 3、端粒的复制： 2009年生理学或医学奖： 三位美国科学家伊丽莎白－布赖克本 （Elizabeth H.Blackburn）、卡罗尔－格雷德 （Carol W.Greider）和杰克－绍斯塔克（Jack W.Szostak） 研究主题是“染色体如何受到端粒和端粒酶的保 护” 端粒酶（ Telomerase） ——逆转录酶 a.核糖核蛋白（ ribonucleoprotein RNP） b.含约长150NT的RNA，其中含 1～5 拷贝的CxAy重复序 列，是合成端粒T2G4序列的模板 端粒酶的 催化机制 爬 行 模 型 为什么端粒酶是一种逆转录酶？