山东农业大学：《农业生物技术》课程教学课件（实验指导，植物组织培养技术，共五个实验）

第一部分植物组织培养技术实验一培养基的制作目的要求（一）熟练掌握常用培养基母液的制备方法。（二）熟练掌握配制MS工作培养基的基本技能和培养基的灭菌方法。：（三）熟练掌握常用仪器设备的使用方法。实验内容一、培养基母液的配制（一）原理培养基主要是由水分、无机物质、有机物质、天然复合物质和凝固剂（或培养体的支持材料）五部分构成。在植物组织培养中，配制培养基是经常性的工作。为了准确称量和快速移取，以及便于贮藏，通常是把培养基先配制成一系列浓缩液，即母液。母液的浓缩倍数一般为10～100倍，可分为大量元素母液、微量元素母液、有机物质母液（维生素、氨基酸等）、铁盐母液和激素类母液等。（二）用品配制MS培养基所需药品：生长调节剂（2，4一D、NAA、IBA、6-BA）：电子天平6台（其中1台为1/1000，1台为1/10000）：500ml烧杯6个；100ml烧杯6个：量筒（1000ml）6个：量筒（500ml）6个：量筒（10ml）12个：容量瓶（1000ml）3个；容量瓶（100ml）3个：各类移液管数只蒸馏水：95%酒精；0.1mol/LNa0H：0.1mol/LHCL；棕色细口母液瓶（1000ml、500ml、100ml）：标签纸3张：冰箱1台；微波炉等。（三）方法与步骤1、MS基本培养基配方：MS培养基化合物用量（mg/L）制备母液应称取量（g）NH, · NO165016.5大量元素190019KNO3MgSO, · 7H,03703. 7KH,PO,1701. 74. 4CaCL,·2H,0440微量元素FeSO,·7H,027.81.39Na2-EDTA37.31.86522.31.115MnSO,:4H,08.6ZnSO,·7H,00.43CoCL,·6H,00.0250.001250.025CuSO,·5H,00.001250.25NaMo,·2H,00.0125KI0.830.0415H,BO,6. 20.31有机物质烟酸（Vpp）0.50.0125盐酸吡哆醇（VB）0.50.01250. 1盐酸硫胺素（VB）0.0025肌醇1002.52甘氨酸0.05

1 第一部分 植物组织培养技术 实验一 培养基的制作 目的要求 （一）熟练掌握常用培养基母液的制备方法。 （二）熟练掌握配制 MS 工作培养基的基本技能和培养基的灭菌方法。； （三）熟练掌握常用仪器设备的使用方法。 实验内容 一、培养基母液的配制 （一）原理 培养基主要是由水分、无机物质、有机物质、天然复合物质和凝固剂（或培养体的支持材料）五 部分构成。 在植物组织培养中，配制培养基是经常性的工作。为了准确称量和快速移取，以及便于贮藏，通 常是把培养基先配制成一系列浓缩液，即母液。母液的浓缩倍数一般为 10～100 倍，可分为大量元 素母液、微量元素母液、有机物质母液（维生素、氨基酸等）、铁盐母液和激素类母液等。 （二）用品 配制 MS 培养基所需药品；生长调节剂（2，4－D、NAA、IBA、6－BA）；电子天平 6 台（其中 1 台为 1/1000,1 台为 1/10000）；500 ml 烧杯 6 个；100 ml 烧杯 6 个；量筒（1000 ml）6 个；量筒 （500 ml）6 个；量筒（10 ml）12 个；容量瓶（1000ml）3 个；容量瓶（100ml）3 个；各类移液管 数只；蒸馏水；95%酒精；0.1mol∕L NaOH；0.1mol∕L HCL；棕色细口母液瓶（1000 ml、500 ml、 100 ml）；标签纸 3 张；冰箱 1 台；微波炉等。 （三）方法与步骤 1、MS 基本培养基配方： MS 培养基 化合物 用量（mg∕L） 制备母液应称取量（g） 大量元素 NH4·NO3 1650 16.5 KNO3 1900 19 MgSO4·7H2O 370 3.7 KH2PO4 170 1.7 CaCL2·2H2O 440 4.4 微量元素 FeSO4·7H2O 27.8 1.39 Na2-EDTA 37.3 1.865 MnSO4·4H2O 22.3 1.115 ZnSO4·7H2O 8.6 0.43 CoCL2·6H2O 0.025 0.00125 CuSO4·5H2O 0.025 0.00125 Na2Mo4·2H2O 0.25 0.0125 KI 0.83 0.0415 H3BO3 6.2 0.31 有机物质 烟酸（Vpp） 0.5 0.0125 盐酸吡哆醇（VB6） 0.5 0.0125 盐酸硫胺素（VB1） 0.1 0.0025 肌醇 100 2.5 甘氨酸 2 0.05

2、配制方法与步骤（1）10倍大量元素母液（1000m1）的配制1）称取NH,NO16.5g，KNO,19g，放入烧杯中，用少量蒸馏水（约100m1）溶解：称取KH,P0,1.7g放入烧杯中，用少量蒸馏水（约100ml）溶解：称取MgS04·7H,03.7.g放入烧杯中，用少量蒸馏水（约100ml）溶解：称取CaCL，·2H,04.4g放入烧杯中，用少量蒸馏水（约100ml）溶解（也可单独配制成100倍母液）。化合物称取量（g）培养基浓度（mg/L)16.5NH, · NO.165019KNO,19003.7370MgSO,·7H,01.7170KH,PO,4.4440CaCL·2H,02）混合：于容量瓶中依次混合上述已溶解的药品：3）定容：加蒸馏水定容至1000ml，即成浓缩10倍的大量元素母液。（2）100倍的微量元素母液（1000m1）的配制1）称量：用电子分析天平准确称取下列药品，分别放入烧杯中，H,BO0.62gMnSO.4H,02.230.86gKI0.083gNaMo,·2H00.025gCuS0,·5H200.0025gg ZnSO,7H,0CoCL，·6H00.0025g加少量蒸馏水（约600ml）溶解；2）定容：溶解后的上述溶液转入1000ml的容量瓶，蒸馏水定容，即成100倍的微量元素母液。5100倍的微量元素母液（500m1）的配制1)称量：用电子分析天平准确称取下列药品，分别放入烧杯中，H,B0，0.31gMnS0,.4H01.120.43gKI0.042gNaMo·2H,00.0125g CuS0,·5H,00.0013ggZnSO,·7H,0CoCL·6H,00.0013g加少量蒸馏水（约200ml）溶解：2）定容：溶解后的上述溶液转入500ml的容量瓶，蒸馏水定容，即成浓缩100倍的微量元素母液。化合物培养基浓度（mg/L)称取量（g）MnSO,· 4H,01.11522.30.438.6ZnSO,·7H,0CoCL,·6H,00.001250. 025CuSO,·5H,00.001250.0250.01250.25Na2Mo,·2H,0KI0.04150.83H,BO,0.316. 2（3）100倍铁盐母液（500m1）的配制1）称量：称取下列药品，分别放入烧杯中，用少量蒸馏水（约100m1）溶解；FeS0,·7H,01.39gNa,-EDTA1.865g2）混合：于500ml烧杯中依次混和两种溶液；3）定容：上述溶液转入500ml的容量瓶，蒸馏水定容，即成浓缩100倍的铁盐母液。培养基浓度（mg/L)化合物称取量（g）1.3927. 8FeSO,·7H,0Na,-EDTA1.86537.32

2 2、配制方法与步骤 （1）10 倍大量元素母液（1000ml）的配制 1）称取 NH4NO3 16.5g，KNO3 19 g，放入烧杯中，用少量蒸馏水（约 100ml）溶解；称取 KH2PO41.7 g 放入烧杯中，用少量蒸馏水（约 100ml）溶解；称取 MgSO4·7H2O 3.7 g 放入烧杯中，用少量蒸馏 水（约 100ml）溶解；称取 CaCL2·2H2O 4.4 g 放入烧杯中，用少量蒸馏水（约 100ml）溶解（也 可单独配制成 100 倍母液）。 化合物 称取量（g） 培养基浓度（mg∕L） NH4·NO3 16.5 1650 KNO3 19 1900 MgSO4·7H2O 3.7 370 KH2PO4 1.7 170 CaCL·2H2O 4.4 440 2）混合：于容量瓶中依次混合上述已溶解的药品； 3）定容：加蒸馏水定容至 1000ml，即成浓缩 10 倍的大量元素母液。 （2）100 倍的微量元素母液（1000ml）的配制 1）称量：用电子分析天平准确称取下列药品，分别放入烧杯中，H3BO3 0.62 g MnSO4.4H2O 2.23 g ZnSO4·7H2O 0.86 g KI 0.083 g Na2Mo4·2H2O 0.025 g CuSO4·5H2O 0.0025 g CoCL2·6H2O 0.0025 g 加少量蒸馏水（约 600ml）溶解； 2）定容：溶解后的上述溶液转入 1000 ml 的容量瓶，蒸馏水定容，即成 100 倍的微量元素母液。  100 倍的微量元素母液（500ml）的配制 1）称量：用电子分析天平准确称取下列药品，分别放入烧杯中，H3BO3 0.31 g MnSO4.4H2O 1.12 g ZnSO4·7H2O 0.43 g KI 0.042 g Na2Mo4·2H2O 0.0125 g CuSO4·5H2O 0.0013 g CoCL2·6H2O 0.0013 g 加少量蒸馏水（约 200ml）溶解； 2）定容：溶解后的上述溶液转入 500 ml 的容量瓶，蒸馏水定容，即成浓缩 100 倍的微量元素 母液。 化合物 称取量（g） 培养基浓度（mg∕L） MnSO4·4H2O 1.115 22.3 ZnSO4·7H2O 0.43 8.6 CoCL2·6H2O 0.00125 0.025 CuSO4·5H2O 0.00125 0.025 Na2Mo4·2H2O 0.0125 0.25 KI 0.0415 0.83 H3BO3 0.31 6.2 （3）100 倍铁盐母液（500 ml）的配制 1）称量：称取下列药品，分别放入烧杯中，用少量蒸馏水（约 100ml）溶解； FeSO4·7H2O 1.39 g Na2-EDTA 1.865 g 2）混合：于 500 ml 烧杯中依次混和两种溶液； 3）定容：上述溶液转入 500 ml 的容量瓶，蒸馏水定容，即成浓缩 100 倍的铁盐母液。 化合物 称取量（g） 培养基浓度（mg∕L） FeSO4·7H2O 1.39 27.8 Na2-EDTA 1.865 37.3

（4）50倍有机物质母液（500m1）的配制1）称量：电子分析天平称取下列药品，放入烧杯中；肌醇2.5g甘氨酸0.05g烟酸（Vpp）0.0125g盐酸吡哆醇（VB）0.0125g盐酸硫胺素（VB,）0.0025g用少量蒸馅馏水（约300ml）溶解2）定容：上述溶液转入500ml的容量瓶，蒸馏水定容，即成浓缩50倍的有机物质母液。化合物称取量（g）培养基浓度（mg/L)0. 5烟酸（Vpp)0.01250. 5盐酸吡哆醇（VB）0.01250. 1盐酸硫胺素（VB,）0.0025肌醇2.51002甘氨酸0.05（5）激素类母液的配制1）称量：用电子分析天平准确称取下列激素类药品各0.1g：IBA、NAA、2.4一D：6一BA。2）溶解：生长素类（IBA、NAA、2.4一D）可先用少量0.1mo1/LNaOH或95%酒精溶解：细胞分裂素类（6一BA）可先用0.1mol/L的HCL溶解：3）定容：将上述已溶解的各激素溶液分别加蒸馏水定容至100ml，即成浓缩至1mg/ml的激素类母液。3、母液的保存（1）装瓶：将配制好的各母液分别转入试剂瓶中，贴上标签，注明培养基名称、母液名称、浓缩倍数、配制日期以及配制1L工作培养基时应移取的量。（2）储藏：将各母液瓶放入冰箱内低温保藏。（四）作业（一）简述各种母液的配制方法与注意事项：（二）熟悉MS基本培养基的配方组成

3 （4）50 倍有机物质母液（500 ml）的配制 1）称量：电子分析天平称取下列药品，放入烧杯中；肌醇 2.5 g 甘氨酸 0.05 g 烟酸（Vpp） 0.0125 g 盐酸吡哆醇（VB6） 0.0125 g 盐酸硫胺素（VB1） 0.0025 g 用少量蒸馏水（约 300ml） 溶解 2）定容：上述溶液转入 500 ml 的容量瓶，蒸馏水定容，即成浓缩 50 倍的有机物质母液。 化合物 称取量（g） 培养基浓度（mg∕L） 烟酸（Vpp） 0.0125 0.5 盐酸吡哆醇（VB6） 0.0125 0.5 盐酸硫胺素（VB1） 0.0025 0.1 肌醇 2.5 100 甘氨酸 0.05 2 （5）激素类母液的配制 1）称量：用电子分析天平准确称取下列激素类药品各 0.1g：IBA、NAA、2,4－D；6－BA。 2）溶解：生长素类（IBA、NAA、2,4－D）可先用少量 0.1mol∕LNaOH 或 95%酒精溶解；细胞分 裂素类（6－BA）可先用 0.1mol∕L 的 HCL 溶解； 3）定容：将上述已溶解的各激素溶液分别加蒸馏水定容至 100ml，即成浓缩至 1mg∕ml 的激素 类母液。 3、母液的保存 （1）装瓶：将配制好的各母液分别转入试剂瓶中，贴上标签，注明培养基名称、母液名称、浓 缩倍数、配制日期以及配制 1L 工作培养基时应移取的量。 （2）储藏：将各母液瓶放入冰箱内低温保藏。 （四）作业 （一）简述各种母液的配制方法与注意事项； （二）熟悉 MS 基本培养基的配方组成

二、工作培养基（MS培养基）的配制（一）原理配制工作培养基时，按照标准配方和终体积，依次量取各种母液于容量瓶（或烧杯）中，再定容至终体积即可。培养基的灭菌通常采用高温高压湿热灭菌法，即在密闭的锅体内，随着压力的上升，水的沸点也随之增加，从而大幅度提高水蒸气的温度。在121.3℃下，保持15～20min，即可达到灭菌目的。（二）用品实验内容一所配制MS培养基的各种母液；琼脂；蔗糖；蒸馏水；0.1mo1/LNaOH；0.1mol/LHCL；移液管：量筒：容量瓶；三角瓶：标签：记号笔：注射器：封口塑料：电磁炉：酸度计：高压灭菌锅等。（三）方法与步骤1、1000m1MS培养基的配制与分装（1）按照母液顺序和所需量，用量筒和专一对应的移液管依次量取下列各母液于容量瓶中；1）10X大量元素母液：100ml：2）100X微量元素母液：10ml：3）100X铁盐母液：10ml：4）50X有机物质母液：20ml；5)加蒸馏水至700ml左右。(2）称取610g琼脂和30g蔗糖（3）调pH：用酸度计或pH试纸测试pH值，可用0.1mol/LNaOH或0.1mol/LHCL将其调到5.8左右。（3）熔化（熬制）：加热煮化。先用旺火烧开，再用文火煮溶。注意经常搅拌，防止糊底和溢出。（4）调pH：待培养基冷却至45℃左右，用酸度计或pH试纸测试pH值，可用0.1mol/LNaOH或0.1mo1/LHCL将其调到5.8左右（或用经验法）。注意：1).培养基适宜PH值5-6.5，一般为5.8，调整用0.1M的NaOH和HC1溶液。2)pH影响培养基的硬度。pH >6.5培养基会变硬，影响营养成分吸收。pH<5.0培养基不易凝固。3)灭菌之前，培养基的pH要比标准提高0.2一0.3个单位。（5）分装与扎口：将调好pH值的培养基分装到培养瓶内。每瓶装20～30ml左右的培养基。分装后上瓶盖，贴上标签，注明培养基的名称、配制时期，配制人姓名或编号等。每人制备2瓶MS固体培养基，100ml培养基可分装3-4瓶，每组5人，可配制300m1培养基平均分装入10瓶中。每组需准备2瓶无菌水，4盒灭菌滤纸。2、培养基的灭菌培养基分装完成后，应在24h内灭菌。灭菌过程如下：（1）加水：（2）装锅；（3）盖盖：（4）加热；（5）排放冷空气：（6）升压保温：（7）降压排气：（8）出锅冷却。3、1便携式灭菌器和立式灭菌器的构造及使用便携式灭菌器（1）构造：便携式灭菌器主要由锅体、内胆、电热管、帘子、锅盖、气压表、放气阀、安全阀、紧定丝母等零部件构成。（2）工作原理：由于在密闭且耐压的容器内，产生的水蒸气可以超过一个大气压，即达到超过100℃的温度（灭菌温度121℃），从而达到灭菌的目的。1个大气压=0.101MPa，灭菌锅内实际压力=1个大气压+压力表指示压力。灭菌压力约2个大气压。（3）使用4

4 二、工作培养基（MS 培养基）的配制 （一）原理 配制工作培养基时，按照标准配方和终体积，依次量取各种母液于容量瓶（或烧杯）中，再定容 至终体积即可。 培养基的灭菌通常采用高温高压湿热灭菌法，即在密闭的锅体内，随着压力的上升，水的沸点也 随之增加，从而大幅度提高水蒸气的温度。在 121.3℃下，保持 15～20min，即可达到灭菌目的。 （二）用品 实验内容一所配制 MS 培养基的各种母液；琼脂；蔗糖；蒸馏水；0.1mol∕LNaOH；0.1mol∕L HCL； 移液管；量筒；容量瓶；三角瓶；标签；记号笔；注射器；封口塑料；电磁炉；酸度计；高压灭菌 锅等。 （三）方法与步骤 1、1000 ml MS 培养基的配制与分装 （1）按照母液顺序和所需量，用量筒和专一对应的移液管依次量取下列各母液于容量瓶中； 1）10X 大量元素母液：100ml； 2）100X 微量元素母液：10 ml；3）100X 铁盐母液：10 ml； 4）50X 有机物质母液：20 ml; 5)加蒸馏水至 700 ml 左右。 (2) 称取 6～10g 琼脂和 30g 蔗糖 （3）调 pH：用酸度计或 pH 试纸测试 pH 值，可用 0.1mol∕LNaOH 或 0.1mol∕L HCL 将其调到 5.8 左右。 （3）熔化（熬制）：加热煮化。先用旺火烧开，再用文火煮溶。注意经常搅拌，防止糊底和溢 出。 （4）调 pH：待培养基冷却至 45℃左右，用酸度计或 pH 试纸测试 pH 值，可用 0.1mol∕LNaOH 或 0.1mol∕L HCL 将其调到 5.8 左右（或用经验法）。 注意：1).培养基适宜 PH 值 5-6.5，一般为 5.8，调整用 0.1M 的 NaOH 和 HCl 溶液 。 2)ｐH 影响培养基的硬度。 ｐH ＞6.5 培养基会变硬，影响营养成分吸收。 ｐH ＜5.0 培养基不易凝固。 3)灭菌之前，培养基的ｐH 要比标准提高 0.2－0.3 个单位。 （5）分装与扎口：将调好 pH 值的培养基分装到培养瓶内。每瓶装 20～30ml 左右的培养基。分 装后拧上瓶盖，贴上标签，注明培养基的名称、配制时期,配制人姓名或编号等。 每人制备 2 瓶 MS 固体培养基，100 ml 培养基可分装 3-4 瓶，每组 5 人，可配制 300 ml 培养基 平均分装入 10 瓶中。每组需准备 2 瓶无菌水，4 盒灭菌滤纸。 2、培养基的灭菌 培养基分装完成后，应在 24h 内灭菌。灭菌过程如下： （1）加水；（2）装锅；（3）盖盖；（4）加热；（5）排放冷空气； （6）升压保温；（7）降压排气；（8）出锅冷却。 3、便携式灭菌器和立式灭菌器的构造及使用 便携式灭菌器 （1）构造：便携式灭菌器主要由锅体、内胆、电热管、帘子、锅盖、气压表、放气阀、安全 阀、紧定丝母等零部件构成。 （2）工作原理：由于在密闭且耐压的容器内，产生的水蒸气可以超过一个大气压，即达到超过 100℃的温度（灭菌温度 121℃），从而达到灭菌的目的。 1 个大气压=0.101MPa ,灭菌锅内实际压力=1 个大气压+压力表指示压力。灭菌压力约 2 个大气 压。 （3）使用

①打开锅盖，加入清水，至接近帘子的程度，然后装入培养物，盖上盖，对角线拧紧丝母：②接通电源，使灭菌器开始工作。当压力表指针升到0.05MPa时，打开放气阀放出冷气，直至回零，关闭放气阀，使灭菌器继续工作。③当压力达到0.10MPa时，开始计算时间，使压力表保持0.10～0.15的范围，维持一定灭菌时间，不同消毒物品所需时间不同，一般灭菌2030min。④放气取物。当灭菌到所需时间时，断开电源，让压力自然下降。当达到0.05MPa时可放出蒸气，至零时，打开锅取出物品。1LHAFAEL-81.外桶，2.锅盖，3.安全阀，4.排气阀，5.气压表，6.内桶7.排气软管，8.支架半自动立式灭菌器（1）构造：立式灭菌器主要由总阀、气压表、放气阀、丝杠扳手、紧定丝母、水碗、进水阀、水位线标志、排水阀、夹层压力表等零部件构成。（2）使用①加水：接通电源，检查水位，打开进水阀，向水碗注入清水直至水位到标志线为止，然后关闭进水阀：②移开上盖装入物品：顺时针方向旋动丝杠扳手使上盖离开上口后，推动横梁移开上盖，装入灭菌物品，注意留有空隙以利消毒彻底③关闭上盖：逆时针转动丝杠扳手直至紧到不能转为止；以下过程同便携式灭菌器

5 ①打开锅盖，加入清水，至接近帘子的程度，然后装入培养物，盖上盖，对角线拧紧丝母； ②接通电源，使灭菌器开始工作。当压力表指针升到 0．05MPa 时，打开放气阀放出冷气，直至 回零，关闭放气阀，使灭菌器继续工作。 ③当压力达到 0．10MPa 时，开始计算时间，使压力表保持 0．10～0．15 的范围， 维持一定灭菌时间，不同消毒物品所需时间不同，一般灭菌 20～30min。 ④放气取物。当灭菌到所需时间时，断开电源，让压力自然下降。当达到 0．05MPa 时可放出蒸气，至零时，打开锅取出物品。 1.外桶 ，2.锅盖，3.安全阀，4.排气阀，5.气压表，6.内桶， 7.排气软管，8.支架 半自动立式灭菌器 （l）构造：立式灭菌器主要由总阀、气压表、放气阀、丝杠扳手、紧定丝母、水碗、进水阀、 水位线标志、排水阀、夹层压力表等零部件构成。 （2）使用 ①加水：接通电源，检查水位，打开进水阀，向水碗注入清水直至水位到标志线为止，然后关 闭进水阀； ②移开上盖装入物品；顺时针方向旋动丝杠扳手使上盖离开上口后，推动横梁移开上盖，装入 灭菌物品，注意留有空隙以利消毒彻底； ③关闭上盖；逆时针转动丝杠扳手直至紧到不能转为止； ④以下过程同便携式灭菌器

压力表温度、压力显示窗温度压力设置钮水位指示灯电源放汽阀培养基高压蒸汽灭菌所必需的最少时间容器体积(mL)121℃灭菌所需最少时间(min)1520-502075-15025250-500100030过滤灭菌I：滤膜0.45um以下针筒滤膜支座针头O1).过滤器先灭菌，灭菌温度不超过121℃。2).溶液先进行初滤（滤膜0.65um）（四）作业（一）说明MS培养基的配制步骤，比较母液与工作液配制的难易程度；（二）简述培养基灭菌的主要环节及使用灭菌器的注意事项。6

6 培养基高压蒸汽灭菌所必需的最少时间 容器体积(mL) 121℃灭菌所需最少时间(min) 20-50 15 75-150 20 250-500 25 1000 30 过滤灭菌Ⅰ: 滤膜 0.45um 以下 1).过滤器先灭菌，灭菌温度不超过 121℃。2).溶液先进行初滤(滤膜 0.65um) （四）作业 （一）说明 MS 培养基的配制步骤，比较母液与工作液配制的难易程度； （二）简述培养基灭菌的主要环节及使用灭菌器的注意事项

实验二无菌操作技术-花生无菌苗的培养一、目的要求通过在超净工作台上进行无菌操作验练，使学生初步掌握组织培养的无菌操作技术。二、原理灭菌是组织培养中重要的工作环节之一，是指采用理化手段杀死物体表面及其孔隙内的一切微生物，包括细菌的芽孢和真菌的孢子。组织培养中要求无菌室、超净工作台达到无菌状态，植物材料也要经过消毒灭菌后再接种，接种人员的双手同样如此。无菌室和超净工作台可采用甲醛、高锰酸钾混合薰蒸，结合紫外灯照射2030分钟：外植体可采用75%酒精和0.1%的升汞杀菌；双手可用70%-75%的酒精棉球擦拭；接种工具可采用75%酒精棉球擦拭，再经火焰灼烧灭菌。三、用品超净工作台、70%-75%的酒精、95%的酒精、盛有培养基的培养瓶、接种器械（主要指解部刀、剪刀、镊子等）、酒精灯、培养材料（根、茎、叶或种子等）、0.1%的升汞（或漂白粉）、无菌水等。四、方法步骤（一）在接种前4h用甲醛与高锰酸钾混合薰蒸接种室，并打开紫外灯照射30min（二）正式接种前半小时左右，打开超净工作台上的紫外灯和风机，20～30min后接种；（三）用肥皂水洗净双手，在缓冲间内穿好灭过菌的实验服、帽子与拖鞋，进入接种室：（四）用70%-75%的酒精擦拭工作台面和双手；（五）用蘸有70%-75%酒精的纱布擦拭装有培养基的培养器血，放进工作台：（六）把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95%酒精中，在火焰上灭菌后，放在器械架上：（七）把植物材料放进70%-75%的酒精中浸泡约30s，再在0.1%的升汞中浸泡5～10min，或在10%的漂白粉上溶液中浸泡10～15min，浸泡时可进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触；然后用无菌水冲洗35次；（八）用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到，打开瓶盖；（九）取下接种器械，在火焰上灭菌：（十）把培养材料迅速放入培养瓶，扎上瓶口（每人接种5～10瓶）。操作期间应经常用75%酒精擦拭工作台和双手：接种器械应反复在95%的酒精中浸泡和在火焰上灭菌：（十一）接种结束后，清理和关闭超净工作台。注：材料的灭菌在接种前必须是材料完全无菌，应注意以下两个方面：1.选取植物组织内部无菌的材料消毒剂对材料消毒时，反表面消毒（1）从健壮的植株上取材，不要取有伤口和病虫的材料（2）晴天的中午或下午取材，不要在雨天、阴天或露水未干时取材。因为健壮的植株和晴天光合呼吸代谢旺盛的组织，自身有抵御病毒侵入的能力，这种组织一般是无菌的。2.完全杀死材料表面带有的各种微生物常用的消毒剂：漂白粉、次氯酸钠（钙）氯化汞H20270%-75%酒精等材料表面消毒的基本要求是既要杀死材料表面的微生物，又要不伤害材料，要求根据不同的材料，选择适当的消毒剂，合适的浓度和处理时间。（1）茎、叶的消毒植物的茎叶多暴露在空气中，有的表面着生茸生、蜡质等，消毒前应用自来水冲洗，并可用肥皂、洗衣粉或吐温等洗涤，再用70%的酒精泡儿秒钟，用无菌水洗2~3次，然后用其他表面消毒剂7

7 实验二 无菌操作技术-花生无菌苗的培养 一、目的要求 通过在超净工作台上进行无菌操作验练，使学生初步掌握组织培养的无菌操作技术。 二、原理 灭菌是组织培养中重要的工作环节之一，是指采用理化手段杀死物体表面及其孔隙 内的一切微生物，包括细菌的芽孢和真菌的孢子。组织培养中要求无菌室、超净工作台 达到无菌状态，植物材料也要经过消毒灭菌后再接种，接种人员的双手同样如此。 无菌室和超净工作台可采用甲醛、高锰酸钾混合薰蒸，结合紫外灯照射 20～30 分钟； 外植体可采用 75%酒精和 0.1%的升汞杀菌；双手可用 70%-75%的酒精棉球擦拭；接种工 具可采用 75%酒精棉球擦拭，再经火焰灼烧灭菌。 三、用品 超净工作台、70%-75%的酒精、95％的酒精、盛有培养基的培养瓶、接种器械（主 要指解剖刀、剪刀、镊子等）、酒精灯、培养材料（根、茎、叶或种子等）、0．1％的 升汞（或漂白粉）、无菌水等。 四、方法步骤 （一）在接种前 4h 用甲醛与高锰酸钾混合薰蒸接种室，并打开紫外灯照射 30min； （二）正式接种前半小时左右，打开超净工作台上的紫外灯和风机，20～30min 后接种； （三）用肥皂水洗净双手，在缓冲间内穿好灭过菌的实验服、帽子与拖鞋，进入接种室； （四）用 70%-75%的酒精擦拭工作台面和双手； （五）用蘸有 70%-75%酒精的纱布擦拭装有培养基的培养器皿，放进工作台； （六）把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在 95％酒精中，在火焰上灭菌后，放在器械架上； （七）把植物材料放进 70%-75%的酒精中浸泡约 30s，再在 0．1％的升汞中浸泡 5～10min，或 在 10％的漂白粉上溶液中浸泡 10～15min，浸泡时可进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触； 然后用无菌水冲洗 3～5 次； （八）用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到，打开瓶盖； （九）取下接种器械，在火焰上灭菌； （十）把培养材料迅速放入培养瓶，扎上瓶口（每人接种 5～10 瓶）。操作期间应经常用 75％ 酒精擦拭工作台和双手；接种器械应反复在 95％的酒精中浸泡和在火焰上灭菌； （十一）接种结束后，清理和关闭超净工作台。 注：材料的灭菌 在接种前必须是材料完全无菌，应注意以下两个方面： 1．选取植物组织内部无菌的材料 消毒剂对材料消毒时，反表面消毒 （1）从健壮的植株上取材，不要取有伤口和病虫的材料 （2）晴天的中午或下午取材，不要在雨天、阴天或露水未干时取材。 因为健壮的植株和晴天光合呼吸代谢旺盛的组织，自身有抵御病毒侵入的能力，这种组织一般 是无菌的。 2．完全杀死材料表面带有的各种微生物 常用的消毒剂：漂白粉、次氯酸钠（钙）氯化汞 H2O2 70%-75%酒精 等 材料表面消毒的基本要求是既要杀死材料表面的微生物，又要不伤害材料，要求根据不同的材 料，选择适当的消毒剂，合适的浓度和处理时间。 （1）茎、叶的消毒 植物的茎叶多暴露在空气中，有的表面着生茸生、蜡质等，消毒前应用自来水冲洗，并可用肥 皂、洗衣粉或吐温等洗涤，再用 70%的酒精泡几秒钟，用无菌水洗 2~3 次，然后用其他表面消毒剂

消毒，再经无菌水清洗，即可用于接种。（2）花药的消毒：用于培养的花药，多数在花蕾散粉前取材，花药的外面常有花、花瓣或颖片的保护，多处于无菌状态，一般将整个花蕾或幼穗表面消毒，不直接取花药消毒。（3）根及地下部器官的消毒接种材料生长于土中，消毒较为困难。除用自来水洗涤外，还应采用软毛刷刷洗后，用纯酒精漂洗，再表面消毒后接种。为了提高灭菌的效果，可将材料浸在消毒液中进行抽气减压，以帮助消毒液的渗入。五、材料的接种及无菌操作要求材料接种的整个过程，一切用具、材料、培养基、培养室，工作人员的衣物等都要无菌，应严格遵守无菌操作规程。3.无菌操作规程（1）入无菌室前，要洗手，去掉指甲中的污物。（2）入室时要穿上经过消毒的工作服，帽子，口罩等（3）操作前要用70%-75%酒精擦洗工作人员的手，操作中要经常用酒精擦洗手。不准讲话，亦不准对着操作区呼吸，以免微生物污染材料、培养基和用具。每次重新操作都要把工具（镊子、解剖刀、剪刀等）在火焰上进行消毒。（4）必须在酒精灯火焰处进行操作，转接材料时，盖瓶盖前应将瓶口在火焰上烧一下，再将盖子在火焰上烧一下，然后盖上。附：花生胚芽的接种实验（一）无菌室和超净工作台的消毒用70%-75%酒精棉球擦拭超净工作台台面、培养瓶表面、无菌水瓶表面、镊子、剪刀等：开启超净工作台，风机调至工作状态，开启工作台紫外灯和无菌室的紫外灯杀菌20-30分钟。（二）花生胚表面消毒和切取每人18粒剥去子叶的花生胚，按小组混合，放入小烧杯，加入70%-75%酒精浸泡30秒，再用0.1%Hgcl2浸泡15分钟（戴手套操作），在无菌条件下用无菌水漂洗3-5次，每次3-5分钟，彻底除去消毒液。（三）花生胚芽的切取和接种每人取18粒表面消毒的的花生胚，在无菌滤纸上切除胚根，切口向下将胚芽接种到MS固体培养基上，每瓶接种8-10个胚芽。培养瓶上贴标签注明姓名、班级和接种日期，放在培养室内培养。（四）接种一周后，观察接种材料的污染情况，并分析污染原因。五、作业（一）将本次实验内容整理成实验报告。（二）接种一周后，观察接种材料的污染情况，并分析污染原因

8 消毒，再经无菌水清洗，即可用于接种。 （2）花药的消毒：用于培养的花药，多数在花蕾散粉前取材，花药的外面常有花萼、花瓣或颖 片的保护，多处于无菌状态，一般将整个花蕾或幼穗表面消毒，不直接取花药消毒。 （3）根及地下部器官的消毒 接种材料生长于土中，消毒较为困难。 除用自来水洗涤外，还应采用软毛刷刷洗后，用纯酒精漂洗，再表面消毒后接种。为了提高灭 菌的效果，可将材料浸在消毒液中进行抽气减压，以帮助消毒液的渗入。 五、材料的接种及无菌操作 要求材料接种的整个过程，一切用具、材料、培养基、培养室，工作人员的衣物等都要无菌， 应严格遵守无菌操作规程。 3．无菌操作规程 （1）入无菌室前，要洗手，去掉指甲中的污物。 （2）入室时要穿上经过消毒的工作服，帽子，口罩等 （3）操作前要用 70%-75%酒精擦洗工作人员的手，操作中要经常用酒精擦洗手。不准讲话， 亦不准对着操作区呼吸，以免微生物污染材料、培养基和用具。每次重新操作都要把工具（镊子、 解剖刀、剪刀等）在火焰上进行消毒。 （4）必须在酒精灯火焰处进行操作，转接材料时，盖瓶盖前应将瓶口在火焰上烧一下，再将盖 子在火焰上烧一下，然后盖上。 附：花生胚芽的接种实验 （一）无菌室和超净工作台的消毒 用 70%-75%酒精棉球擦拭超净工作台台面、培养瓶表面、无菌水瓶表面、镊子、剪刀等；开启 超净工作台，风机调至工作状态，开启工作台紫外灯和无菌室的紫外灯杀菌 20-30 分钟。 （二）花生胚表面消毒和切取 每人 18 粒剥去子叶的花生胚，按小组混合，放入小烧杯，加入 70%-75%酒精浸泡 30 秒，再用 0.1% Hgcl2 浸泡 15 分钟（戴手套操作），在无菌条件下用无菌水漂洗 3-5 次，每次 3-5 分钟，彻底除 去消毒液。 （三）花生胚芽的切取和接种 每人取 18 粒表面消毒的的花生胚，在无菌滤纸上切除胚根，切口向下将胚芽接种到 MS 固体培 养基上，每瓶接种 8-10 个胚芽。培养瓶上贴标签注明姓名、班级和接种日期，放在培养室内培养。 （四）接种一周后，观察接种材料的污染情况，并分析污染原因。 五、作业 （一）将本次实验内容整理成实验报告。 （二）接种一周后，观察接种材料的污染情况，并分析污染原因

附灭菌和接种一、灭菌灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者首先要清楚有菌和无菌的范畴。有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。依此观点，无菌室等未经处理的地方、超净台表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表，如整个消化道、呼吸道，即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多于净等等都是有菌的。这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其它微生物。菌的特点是：极小，肉眼看不见。无处不在，无时不有，无孔不入。在自然条件下忽耐力强，生活条件要求简单，紧殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其它物理的或化学的灭菌方法处理后的物体（当然这些方法必须已经证明是有效的），高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部等等都是无菌的。从以上可以看出：在地球表面无菌世界要比有菌世界小得多。灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。与此相关的一个概念是消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即消毒后的环境里、物品上还有活着的微生物。而通过严格灭菌的操作空间（接种室、超净台、等）和使用的器血，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行操作，就叫做无菌操作。植物组织培养对无菌条件的要求是非常严格的，甚至超过微生物的培养要求，这是因为培养基含有丰富的营养，稍不小心就引起杂菌污染。要达到彻底灭菌的目的，必须根据不同的对象采取不同的切实有效的方法灭菌，才能保证培养时不受杂菌的影响，使试管苗能正常生长。常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施。化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钟、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。1.培养基用湿热灭菌培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1～0.15MPa20分钟。按容器大小不同，保压时间有所不同（表4一1）。该表所列数字是彻底灭菌很保险的数字，如果容器体积较大，但是放置的数量很少，也可以减少时间。表4—1培养基高压蒸气灭菌所必需的最少时间容器的体积（ml）在121℃灭菌所需最少时间（min）20~501 575~1502 02 5250~500100030到达保压时间后，即可切断电源，在压力降到0.05MPa，可缓慢放出蒸气，应注意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。当压力降到零后，才能开盖，取出培养基摆在平台上，以待冷凝。不可久不放气，引起培养基成分变化，以至培养基无法摆斜面。一旦放置9

9 附 灭菌和接种 一、灭菌 灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者首先要清楚有菌和无菌的范畴。有菌的范畴是：凡是暴露 在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。依此观点，无菌室等未经处理 的地方、超净台表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表 及与外界相连的内表，如整个消化道、呼吸道，即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等 都是有菌的。 这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其它微生物。菌的特点是：极小，肉眼看不见。 无处不在，无时不有，无孔不入。在自然条件下忍耐力强，生活条件要求简单，繁殖力极强，条件 适宜时便可大量滋生。 无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其它物理的或化学的灭菌方法处理后的 物体(当然这些方法必须已经证明是有效的)，高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接 触的组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部等等都是无菌的。从以上可以看出：在地 球表面无菌世界要比有菌世界小得多。 灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物 质全部杀死。与此相关的一个概念是消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生 危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即消毒后的环境里、 物品上还有活着的微生物。而通过严格灭菌的操作空间（接种室、超净台、等）和使用的器皿，以 及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行操作，就叫做无菌操作。 植物组织培养对无菌条件的要求是非常严格的，甚至超过微生物的培养要求，这是因为培养基含有 丰富的营养，稍不小心就引起杂菌污染。要达到彻底灭菌的目的，必须根据不同的对象采取不同的 切实有效的方法灭菌，才能保证培养时不受杂菌的影响，使试管苗能正常生长。 常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸 煮）、射线处理（超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施。化学方法是使用升汞、甲 醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和 药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。 1．培养基用湿热灭菌 培养基在制备后的 24 小时内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的 蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。 在 0.1MPa 的压力下，锅内温度达 121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的 芽孢。 注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法， 但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待 压力上升到 0.05MPa 时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。 关阀再通电后，压力表上升达到 0.1MPa 时,开始计时，维持压力 0.1～0.15MPa 20 分钟。 按容器大小不同，保压时间有所不同（表 4－１）。该表所列数字是彻底灭菌很保险的数字，如果容 器体积较大，但是放置的数量很少，也可以减少时间。 表 4－１ 培养基高压蒸气灭菌所必需的最少时间 容器的体积（ml） 在 121℃灭菌所需最少时间（min） ２０～５０ １５ ７５～１５０ ２０ ２５０～５００ ２５ １０００ ３０ 到达保压时间后，即可切断电源，在压力降到 0.05MPa，可缓慢放出蒸气，应注意不要使压力降低 太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。当压力降到零后，才能开盖，取出培养基， 摆在平台上，以待冷凝。不可久不放气，引起培养基成分变化，以至培养基无法摆斜面 。一旦放置

过久，由于锅炉内有负压，盖子打不开，只要将放气阀打开，大气压入，内外压力平衡，盖子便易打开了。对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，义要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。对于一些布制品，如实验服、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌2030分钟。高压灭菌前后的培养基，其pH值下降0.2～0.3单位。高压后培养基pH值的变化方向和幅度取决于多种因素。在高压灭菌前用碱调高pH至预定值的则相反。培养基中成分单一时和培养基中含有高或较高浓度物质时，高压灭菌后的pH值变化幅度较大，甚至可大于2个pH单位。环境pH值的变化大于0.5单位就有可能产生明显的生理影响。高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，从而改变培养基的渗透压。在8%～20%蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基约升高0.43倍。培养基中的铁在高压灭菌时会催化煎糖水解，可使15%25%的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培养基值小于5.5，其水解量更多，培养基中添加0.1%活性碳时，高压下煎糖水解大大增强，添加1%活性碳，蔗糖水解率可达5%。为防止高压灭菌产生的上述一些变化可用下列方法：（1）经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料，以便及时采取有效措施。（2）设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量（在0.1%以下）注意PH值对高压灭菌下培养基中成分的影响等。（3）配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。如将磷、钙和铁放在最后加入。（4）注意高压灭菌后培养基pH的变化及回复动态。如高压灭菌后的pH值常由5.80升高至6.48。而96h后又回降至5.8左右。这样在实验中就可以根据这一规律加以掌握。2.用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500ml的广口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。3.玻璃器血及耐热用具采用干热灭菌干热灭菌是利用烘箱加热到160～180℃的温度来杀死微生物。由于在干热条件下，细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近芽孢的抗热水平，通常采用1700C持续90分钟来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的塑料。灭菌时应渐进升温，达到预定温度后记录时间.烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免妨碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭菌能源消耗太大，浪费时间。4.不耐热的物质采用过滤灭菌一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。防细菌滤膜的网孔的直径为0.45Ⅲ以下，当溶液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的抱子等因大于滤膜直径而被阻，在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置：液量小时，可用注射器。使用前对其高压灭菌，将滤膜装在注射器的近针管处，将待过滤的液体装入注射器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压出的溶液就是无菌溶液。5.空间采用紫外线和熏蒸灭菌（1）紫外线灭菌在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌。细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。紫外线的波长为200～300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，但是紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，且要求距照射物以不超过1.2米为宜。10

10 过久，由于锅炉内有负压，盖子打不开，只要将放气阀打开，大气压入，内外压力平衡，盖子便易 打开了。 对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。而 培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意 延长时间。 对于一些布制品，如实验服、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌 20～30 分钟。 高压灭菌前后的培养基，其 pH 值下降 0.2～0.3 单位。高压后培养基 pH 值的变化方向和幅度取决 于多种因素。在高压灭菌前用碱调高 pH 至预定值的则相反。培养基中成分单一时和培养基中含有 高或较高浓度物质时，高压灭菌后的 pH 值变化幅度较大，甚至可大于 2 个 pH 单位。环境 pH 值的变 化大于 0．5 单位就有可能产生明显的生理影响。 高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，从而改变培养基的渗透压。 在 8％～20％蔗糖范围 内，高压灭菌后的培养基约升高 0.43 倍。 培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使 15％～25％的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培养基 值小于 5．5，其水解量更多，培养基中添加 0．1％活性碳时，高压下蔗糖水解大大增强，添加 1％ 活性碳，蔗糖水解率可达 5％。 为防止高压灭菌产生的上述一些变化可用下列方法： （1）经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料，以便及时采取有效措施。 （2）设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。如避免使用果糖和山梨醇而 用甘露醇，以 IBA 代替 IAA，控制活性炭的用量（在 0.1％以下）注意 PH 值对高压灭菌下培养基中 成分的影响等。 （3）配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。如将磷、钙和铁放在最后加入。 （4) 注意高压灭菌后培养基 pH 的变化及回复动态。如高压灭菌后的 pH 值常由 5．80 升高至 6．48。 而 96h 后又回降至 5.8 左右。这样在实验中就可以根据这一规律加以掌握。 2. 用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌 在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入 95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭 菌。冷却后，立即使用。操作中可采用 250 或 500ml 的广口瓶，放入 95%的酒精，以便插入工具。 3.玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌 干热灭菌是利用烘箱加热到 160～180℃的温度来杀死微生物。由于在干热条件下，细菌的营养细胞 的抗热性大为提高，接近芽孢的抗热水平，通常采用 170０Ｃ持续 90 分钟来灭菌。干热灭菌的物品 要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的塑料。灭 菌时应渐进升温，达到预定温度后记录时间．烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免妨碍热对流 和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭菌能 源消耗太大，浪费时间。 4. 不耐热的物质采用过滤灭菌 一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通 常采用过滤灭菌方法。 防细菌滤膜的网孔的直径为 0.45μm 以下，当溶液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于 滤膜直径而被阻，在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置；液量小时，可用注射器。使用 前对其高压灭菌，将滤膜装在注射器的近针管处，将待过滤的液体装入注射器，推压注射器活塞杆， 溶液压出滤膜，从针管压出的溶液就是无菌溶液。 5.空间采用紫外线和熏蒸灭菌 （1）紫外线灭菌 在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌。 细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。紫外线的波 长为 200～300nm，其中以 260nm 的杀菌能力最强，但是紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于 空气和物体表面的灭菌，且要求距照射物以不超过 1.2 米为宜