贵州师范大学：《生物化学与分子生物学实验》课程教学课件（PPT讲稿）实验十 PCR扩增基因

实验十 PCR扩增基因

实验十 PCR扩增基因

实验目的.....................实验原理试剂器材实验步骤思考题5

1 实验目的 2 实验原理 3 试剂器材 4 实验步骤 5 思考题

实验日的通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术

实验目的 通过本实验学习PCR反应的基本原理与 实验技术

实验原理多聚酶链式反应（polymerasechainreactionPCR）基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苗酸引物。PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCI2、两个合成的DNA引物、耐热Tag聚合

实验原理 多聚酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）基本原理类似于 DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷 酸引物。PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成。 典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、 dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热 Taq聚合酶

器材试剂1.仪器与耗材：PCR热循环仪，琼脂糖凝胶电泳系统移液枪、PCR管。2.试剂（1)10XPCR Buffer（2）dNTP（其中包括dATP、dCTP、dGTP与dTTP：（3）上游引物和下游引物（10μM）（4）DNA模板（5）TaqDNA聚合酶

器材试剂 1.仪器与耗材：PCR热循环仪，琼脂糖凝胶电泳系统， 移液枪、PCR管。 2.试剂 （1）10×PCR Buffer （2）dNTP（ 其中包括dATP、dCTP、dGTP与dTTP；） （3）上游引物和下游引物（10 μM） （4）DNA模板 （5）Taq DNA聚合酶

实验步骤1.PCR反应体系（25u1）体积/ul反应物2.510×PCRMg2+1.01. 02.5mmol/LdNTP上游引物1.0下游引物1.0Taq DNA0. 2模板1. 0加H2017.3

实验步骤 1.PCR反应体系(25ul) 反应物 体积/ul 10×PCR 2.5 Mg2+ 1.0 2.5mmol/L dNTP 1.0 上游引物 1.0 下游引物 1.0 Taq DNA 0.2 模板 1.0 加H2O 17.3

2.反应条件：在PCR热循环仪上设置以下程序，按程序设置的条件进行扩增。（1）94℃预变性5min；（2）94℃变性45s（3）55℃退火45s；（4）72℃延伸60s（5）重复步骤（2）～（4）30次（6）72℃延伸10min；(7) 4℃ 0

2.反应条件： 在PCR热循环仪上设置以下程序，按程序 设置的条件进行扩增。 （1）94℃预变性5min； （2）94℃变性45s; （3）55℃退火45s； （4）72℃延伸60s； （5）重复步骤（2）～（4）30次； （6）72℃延伸10min； （7）4℃ ∞

3.琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果：配制1%琼脂糖凝胶，取5uL扩增产物与1ul上样缓冲液混匀，电泳。保持电压120V。电泳结束后在紫外灯下观察结果

3. 琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果： 配制1％琼脂糖凝胶，取5 μL扩增产物与1ul上样 缓冲液混匀，电泳。保持电压120V。电泳结束后， 在紫外灯下观察结果

思考题影响PCR反应效率的因素有哪些？

思考题 影响PCR反应效率的因素有哪些？