贵州师范大学：《生物化学与分子生物学实验》课程教学课件（PPT讲稿）实验一 氨基酸的分离鉴定——纸层析法

实验一氨基酸纸层析法

氨基酸纸层析法 实验一

一、实验目的1.了解氨基酸的分离2.掌握纸上层析的基本原理和操作方法

一、实验目的 1.了解氨基酸的分离 2. 掌握纸上层析的基本原理和操作方法

实验原理二、纸层析是以滤纸为情性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相当有机相流经固定相时，氨基酸在两相间不断分配而得到分离溶质在滤纸上的移动速度用R值表示：R，=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离=X/Y溶剂前层析斑点原点在一定的条件下某种氨基酸的R,值是常数。R,值的大小与氨基酸的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关

二、实验原理 ⚫ 纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具 有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。当有机 相流经固定相时，氨基酸在两相间不断分配而得到分离。 ⚫ 溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示： Rf =原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离= X/Y ⚫ 在一定的条件下某种氨基酸的Rf值是常数。 Rf值的大小与氨基酸 的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有 关

三实验器材（1）层析缸：两组一台（2）毛细管：每瓶专用，切勿混用。（3）层析滤纸：1张/组。（4）直尺、铅笔：自备

三、实验器材 （1）层析缸：两组一台 （2）毛细管 :每瓶专用，切勿混用。 （3）层析滤纸：1张/组。 （4）直尺、铅笔：自备

四、实验试剂1.展层剂正丁醇：80%甲酸：水=15：3:2，充分摇匀。2.样品液用水配成每m含有赖氨酸、谷氨酸、氨酸各0.5%的氨基酸溶液，以及上述三种氨基酸的混合液（0.5%）。3.显色剂0.5g节三酮溶于100mL丙酮

四、实验试剂 1. 展层剂 正丁醇:80%甲酸:水=15:3:2，充分摇匀。 2. 样品液 用水配成每ml含有赖氨酸、谷氨酸、缬氨酸各0.5%的氨基酸溶 液，以及上述三种氨基酸的混合液(0.5%)。 3. 显色剂 0.5g茚三酮溶于100mL丙酮

五、实验操作（1）规划：取宽层析滤纸一张在纸的下端距边缘2cm处轻B轻用铅笔划一条平行于底边16的直线A，在直线上做4个记号，记号之间间隔2cm，这12就是原点的位置。8另可在距左边缘1cm处画一条平行于左边缘的直线B，在B.线上以A、B两线的交点为原点标明刻度（以cm为单位），0参见左图

（1）规划：取宽层析滤纸一张。 在纸的下端距边缘2cm处轻 轻用铅笔划一条平行于底边 的直线A，在直线上做4个记 号，记号之间间隔2cm，这 就是原点的位置。 另可在距左边缘1cm处画一条 平行于左边缘的直线B，在B 线上以A、B两线的交点为原 点标明刻度（以cm为单位）， 参见左图。 五、实验操作

（2）点样：在每个圈下用铅笔记上每种氨基酸的代号（混合样可写M），然后用毛细管吸取样品，轻轻地点到相应的氨基酸圈内，可待晾干后再点第二次。（3）层析：将层析缸中放入展层剂，把滤纸放置于层析缸中，切勿使滤当溶纸碰到层析缸。样品端向下垂直放置，切勿使展层剂浸到样品点剂前沿到达滤纸2/3处，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿

（2）点样：在每个圈下用铅笔记上每种氨基酸的代号(混合样可写M)，然 后用毛细管吸取样品，轻轻地点到相应的氨基酸圈内，可待晾干后再点 第二次。 （3）层析：将层析缸中放入展层剂，把滤纸放置于层析缸中，切勿使滤 纸碰到层析缸。样品端向下垂直放置，切勿使展层剂浸到样品点。当溶 剂前沿到达滤纸2/3处，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿

（4）显色：凉干滤纸至显出氨基酸斑点，用铅笔描出轮廓。参见左图。强调：记下点样顺序！！！烘干显色后，将样品名和小组名字写上，随实验报告一起交！

⚫ （4）显色：凉干滤纸至 显出氨基酸斑点，用铅笔 描出轮廓。参见左图。 ⚫ 强调：记下点样顺序！！！ 烘干显色后，将样 品名和小组名字写 上，随实验报告一 起交！

（5）计算各种氨基酸的R，值，并判断混合样品中都有哪些氨基酸，各人将自己的实验结果贴在实验报告上，见表3-2。（6）回收用过的展层液，整理好桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台。(8)计算R

⚫ （5）计算各种氨基酸的Rf值，并判断混合样品中 都有哪些氨基酸，各人将自己的实验结果贴在实 验报告上，见表3-2。 ⚫ （6）回收用过的展层液，整理好桌面上的仪器和 试剂，并注意清洁自己的操作台。 ⚫ （8）计算 Rf

纸层析结果赖氨酸谷氨酸缬氨酸待测氨基酸原点到层析斑点中心的距离原点到溶剂前沿的距离R,判断待测氨基酸

纸层析结果 赖氨酸 谷氨酸 缬氨酸 待测氨基酸 原点到层析斑点 中心的距离 原点到溶剂前沿 的距离 Rf 判断待测氨基酸