厦门大学：《生物化学实验》课程教学资源（讲稿）碱性磷酸酶Km测定

碱性磷酸酶Km值的测定王世珍

碱性磷酸酶Km值的 测定 王世珍

【实验目的】1.了解酶的Km值测定原理和方法（AKP）活性测2．掌握碱性磷酸酶定的原理和方法

【实验目的】 1.了解酶的Km值测定原理和方法 2．掌握碱性磷酸酶（AKP）活性测 定的原理和方法

【实验原理）·在温度，pH及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度随底物浓度（S）增大而增加但当底物浓度增大到一定极限时，则反应速度趋于恒定，此最大反应速度Vmax，反应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方程来表示，即：

【实验原理】 • 在温度，pH及酶浓度恒定的条件下，酶促 反应的初速度随底物浓度（S）增大而增加， 但当底物浓度增大到一定极限时，则反应 速度趋于恒定，此最大反应速度Vmax，反 应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方 程来表示，即：

酶的底物浓度与酶促反应速度的关系一般情况下符合米氏（Michaelis-Menten）理论根据中间产物学说，酶促反应的动力学模型可以表示为：k1k2E + SESE+Pk-1oVo时间（分）图酶反应进程曲钱+

酶的底物浓度与酶促反应速度的关系一般 情况下符合米氏（Michaelis-Menten）理论。 根据中间产物学说，酶促反应的动力学模 型可以表示为： E + S ES E + P k1 k-1 k2

·E、S、ES和P分别表示酶、底物、酶底物中间物和产物；k1、k.1、k是各步反应的速度常数。按照中间产物学说，可以推导出米氏方程为：max零级反应混合级反应Vm [S]-Vmax1Km +[S]一级反应[S]底物浓度对反应初速度的影响式中：[S]为底物浓度：v为初速度：Vm为最大反应速度）；Km为米氏常数

• E、S、ES和P分别表示酶、底物、酶底物 中间物和产物；k1、k-1、k2是各步反应的速 度常数。按照中间产物学说，可以推导出 米氏方程为： v V S K S m m    [ ] [ ] 式中：[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度）；Km 为米氏常数 底物浓度对反应初速度的影 响

·测定K2和Vm特别是测定Km是酶学工作的基本内容之一·在酶动力学性质的分析中，米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数K往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。K数值越尔，说明酶和底物的亲和力越强；反之，Km值越大，酶和底物的亲和力越弱

• 测定Km和Vm，特别是测定Km是酶学工作的 基本内容之一。 • 在酶动力学性质的分析中，米氏常数Km是 酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底 物结合和解离的性质。 • 特别是同一种酶能够作用于几种不同底物 时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种 底物的亲和力的强弱。Km数值越小，说明 酶和底物的亲和力越强；反之，Km值越大， 酶和底物的亲和力越弱

测定Km和Vm，可通过作图法求得采用最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即1v1K1mV.VKm[S]VVmaxmmV[6Lineweaver-Burk双倒数作图

测定Km和Vm，可通过作图法求得 采用最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形 式，即 1 1 1 v K V S V m m m    [ ] Lineweaver-Burk 双倒数作图

酶催化反应体系·碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）正式化学名为磷酸单酯水解酶（EC3.1.3.1），是一种非特异性的水解酶，最适pH为7.6～10.4。不同来源的AKP，其分子量和亚基结构各不相同。小牛肠碱性磷酸酶分子量为145kDa，等电点为5.7，最适pH值为10.0

酶催化反应体系 • 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase， AKP） 正式化学名为磷酸单酯水解酶（EC 3.1.3.1），是一种非特异性的水解酶，最 适pH为7.6～10.4。不同来源的AKP，其分 子量和亚基结构各不相同。小牛肠碱性磷 酸酶分子量为145kDa，等电点为5.7，最适 pH值为10.0

反应体系pNPP+H,OpNP+HPO.2黄色无色

反应体系 pNPP+H2O pNP+HPO4 → 2- 无色 黄色

【实验操作】23456No.10.61.1.53.00.75底物浓度[S](mmol/L)0.50000.0.10.60.10.150.310mmol/LpNPP(mL)220.重蒸水（mL）0.60.50.550.40.158各管加入1.0mlNa,CO3-NaHCO3(mL)MgCl2(mL)各管加入0.2mL预热37℃5min100LALPase酶液(L)反应时间(min)精确反应10min各管加入2.0mL0.2mol/LNaOH(mL)空白管补加酶液1'-6'对照管补加100uL酶液OD405nm

混匀后37℃水浴，预温5分钟左右 【实验操作】 No. 1 2 3 4 5 6 底物浓度[S](mmol/L) 0.50 0.6 0 0.75 1. 0 1.5 3.0 10mmol/L pNPP(mL) 0.1 0.1 2 0.15 0. 2 0.3 0.6 重蒸水（mL） 0.6 0.5 8 0.55 0. 5 0.4 0.1 Na2CO3 -NaHCO3 (mL) 各管加入1.0mL MgCl2 (mL) 各管加入0.2mL 预热 37℃ 5min ALPase酶液(L) 100L 反应时间(min) 精确反应10min 0.2 mol/L NaOH(mL) 各管加入2.0mL 空白管补加酶液 1´-6´对照管补加100μL酶 液 OD405nm 1/OD