内蒙古农业大：生命科学学院《生物技术制药实验》课程教学资源（实验指导书，共十七个）

生物技术制药实验2018年3月

生物技术制药实验 2018 年
3 月

实验相关注意事项精确的实验技术，良好的实验习惯，是基因工程实验获得成功的有效保证：分子生物学是一门新兴学科，可以解决生物学中许多以前解决不了的问题。随着分子生物学的发展，其应用范围也越来越广，做基因工程实验的人也日益增多，但许多实验人员在实验中经常犯这样那样的错误。这里，我们根据本实验室以前的经验，总结了一些常见的错误供同行借鉴以减少同样的错误，使大家更有效、更愉快地开展工作。(一)心理素质问题做基因工程实验实际上也是一种人的活动，所以个人的心理素质对实验是有影响的，一般来讲，平常心态稳定、习惯良好的人，实验的成功率要高，反之则低些。下面我们例举的是实验中遇到的实验人员心理问题。1.不能正确对待基因工程实验分子生物学是一门年轻的学科，40余年。应用十分广泛，发展特别快，已开始形成了一套完整而成熟的基础理论和实验体系。涉及的知识领域广泛，许多学科的新进展都很快与它联系起来，有一定的神秘性，没有进分子生物学这个门的人，有一些畏惧心理。实际上基础理论本身还是比较简明具体，同时它的实验操作也都有专门的书籍详细介绍（如《分子克隆》），读上几本基础书，再到有经验的实验室去实践，在较短的时间内是可以入门的。另一方面，有些已具有部分分子生物学知识的人，很多实验的实验步骤经过前人的不断改进，变得十分的简便，有些大的实验在几天内即可完成，便认为基因工程实验简单，产生轻视心理，这种心理同样也是有害的。因为基因工程实验的操作是精细而微量的，本身中间步骤多且用直观方法难以检测，实验中的每一种试剂，每一个步骤出错都可能是致命的，可导致实验完全失败，所以基因工程实验是不能完全按实验流程来计算时间的。例如在本实验室做基因拼接，按标准实验程序，合成完寡聚核苷酸片段后只需10天即可完成拼接、克隆及测序鉴定，但在实际中，还没有人能在10天内做完。由于各种各样的原因（包括试剂、操作及个人心理素质等），平均要2个月左右才能完成这样一个工作。所以，轻视心理也是必须纠正的。总之，对待基因工程实验，引用伟人毛泽东的一句话“在战略上渺视它，在战术上重视它”，才是正确的态度。2.用微量试剂不习惯在基因工程实验中，试剂的用量往往很少，液体常常可用到1微升即1X10”毫升，而普通的一滴水就有20～100微升；固体物质可用到微克甚至纳克级，这是平常肉眼看不见的。1

I 实验相关注意事项 精确的实验技术，良好的实验习惯，是基因工程实验获得成功的有效保证：分子生物学 是一门新兴学科，可以解决生物学中许多以前解决不了的问题。随着分子生物学的发展，其 应用范围也越来越广，做基因工程实验的人也日益增多，但许多实验人员在实验中经常犯这 样那样的错误。这里，我们根据本实验室以前的经验，总结了一些常见的错误供同行借鉴， 以减少同样的错误，使大家更有效、更愉快地开展工作。 (一)心理素质问题 做基因工程实验实际上也是一种人的活动，所以个人的心理素质对实验是有影响的，一 般来讲，平常心态稳定、习惯良好的人，实验的成功率要高，反之则低些。下面我们例举的 是实验中遇到的实验人员心理问题。 1．不能正确对待基因工程实验 分子生物学是一门年轻的学科， 40 余年。应用十分广泛，发展特别快，已开始形成了 一套完整而成熟的基础理论和实验体系。涉及的知识领域广泛，许多学科的新进展都很快与 它联系起来，有一定的神秘性，没有进分子生物学这个门的人，有一些畏惧心理。实际上基 础理论本身还是比较简明具体，同时它的实验操作也都有专门的书籍详细介绍(如《分子克 隆》)，读上几本基础书，再到有经验的实验室去实践，在较短的时间内是可以入门的。 另一方面，有些已具有部分分子生物学知识的人，很多实验的实验步骤经过前人的不断 改进，变得十分的简便，有些大的实验在几天内即可完成，便认为基因工程实验简单，产生 轻视心理，这种心理同样也是有害的。因为基因工程实验的操作是精细而微量的，本身中间 步骤多且用直观方法难以检测，实验中的每一种试剂，每一个步骤出错都可能是致命的，可 导致实验完全失败，所以基因工程实验是不能完全按实验流程来计算时间的。例如在本实验 室做基因拼接，按标准实验程序，合成完寡聚核苷酸片段后只需 10 天即可完成拼接、克隆及 测序鉴定，但在实际中，还没有人能在 10 天内做完。由于各种各样的原因(包括试剂、操作 及个人心理素质等)，平均要 2 个月左右才能完成这样一个工作。所以，轻视心理也是必须纠 正的。 总之，对待基因工程实验，引用伟人毛泽东的一句话“在战略上渺视它，在战术上重视 它’’才是正确的态度。 2．用微量试剂不习惯 在基因工程实验中，试剂的用量往往很少，液体常常可用到 l 微升即 1X10”毫升，而普 通的一滴水就有 20～100 微升；固体物质可用到微克甚至纳克级，这是平常肉眼看不见的

所以刚刚接触基因工程实验的人，总是担心要取的东西能否取到，准不准确，操作的样品是不是会丢失。总是加大用量，认为多总比少好，实际上这些顾虑是多余的。在基因工程实验中，一般都有专门的仪器设备检测和观察样品，有一整套方法保证取样的正确。许多样品的量很少，肉眼看不见，而肉眼看不见通常意味着样品纯度好，不带杂质，超量使用酶等试剂反而会干扰正确的结果。所以实验人员必须在心理上逐渐适应用这些微量概念。3.粗心大意在基因工程实验中，由于粗心大意造成的错误可说是“千奇万怪”，在每一个实验中几乎都可以举出实例。在一个课题的研究中，可能要用到一系列的实验，每一个实验中又包含几个小实验，小实验中又有许多具体的步骤，每一个步骤中又用到许多试剂，在这些过程中因为粗心大意都有出错的可能，产生的后果小则重做某一步骤，大则整个课题必须重新开头。主要表现为试剂配制错误；样品取错：实验顺序颠倒；样品混；样品意外去失：加错试剂；看错实验条件等等不一而足。例如某人大量制备DNA，所有的细菌培养、扩增及碱法抽提、分步纯化、乙醇沉淀DNA都已做完，最后离心收集DNA时，不小心将离心管碰翻在地上，样品全部丢失，一周成果全部损失。我们建议实验人员要克服粗心大意的不良习惯，严格细心地做每一步操作，以保证整体实验的顺利进行。4.缺乏整体实验的概念许多实验人员在刚开始一项新的实验时，对整个实验过程缺少全面的了解，对实验需要多少时间？要用何种试剂?用量多少？要用到何种实验材料？何种实验设备等都没有概念，往往实验做到中途，再急匆来寻找缺少的东西。基因工程实验中，所用到的试剂、药品通常都价钱昂贵，一般实验室不可能储备得种类齐全而又充足，另外许多试剂还依赖进口，购买周期长，这就会迫使实验中途停止，致使实验效率严重降低，有的实验不能中途停顿，就可能使整个实验全部失败。我们建议实验人员在做分子生物学实验之前，应在基础知识、实验方法、实验材料及实验试剂上有充分的准备，在实验时间上做好充分的安排，以保证实验的顺利开展。5.侥幸心理侥幸心理是基因工程实验中致使实验人员犯错误最多的原因，想省时间、省步骤及因对前一步实验盲目自信是产生这种心理的主要原因。因为基因工程实验方法是在依据分子生物学基础理论的基础上，辅以前人大量的实验经验而建立的，实验条件的细小改变，不一定会使实验失败，但几个步骤的细小改变，累积起来必出大错。做基因工程实验每个步骤的结果，在能够检测的条件下都应检测，否则不应进入下一步实验。由于各种原因，实验人员经常省略检测这一步，从表面看省了事，实际上使后面的实验失去了保证，最后实验失败且连原因II

II 所以刚刚接触基因工程实验的人，总是担心要取的东西能否取到，准不准确，操作的样品是 不是会丢失。总是加大用量，认为多总比少好，实际上这些顾虑是多余的。在基因工程实验 中，一般都有专门的仪器设备检测和观察样品，有一整套方法保证取样的正确。许多样品的 量很少，肉眼看不见，而肉眼看不见通常意味着样品纯度好，不带杂质，超量使用酶等试剂 反而会干扰正确的结果。所以实验人员必须在心理上逐渐适应用这些微量概念。 3. 粗心大意 在基因工程实验中，由于粗心大意造成的错误可说是“千奇万怪”，在每一个实验中几乎 都可以举出实例。在一个课题的研究中，可能要用到一系列的实验，每一个实验中又包含几 个小实验，小实验中又有许多具体的步骤，每一个步骤中又用到许多试剂，在这些过程中因 为粗心大意都有出错的可能，产生的后果小则重做某一步骤，大则整个课题必须重新开头。 主要表现为试剂配制错误；样品取错；实验顺序颠倒；样品混淆；样品意外丢失；加错试剂； 看错实验条件等等不一而足。例如某人大量制备 DNA，所有的细菌培养、扩增及碱法抽提、 分步纯化、乙醇沉淀 DNA 都已做完，最后离心收集 DNA 时，不小心将离心管碰翻在地上，样 品全部丢失，一周成果全部损失。我们建议实验人员要克服粗心大意的不良习惯，严格细心 地做每一步操作，以保证整体实验的顺利进行。 4．缺乏整体实验的概念 许多实验人员在刚开始一项新的实验时，对整个实验过程缺少全面的了解，对实验需要 多少时间?要用何种试剂?用量多少?要用到何种实验材料?何种实验设备等都没有概念，往往 实验做到中途，再急匆匆来寻找缺少的东西。基因工程实验中，所用到的试剂、药品通常都 价钱昂贵，一般实验室不可能储备得种类齐全而又充足，另外许多试剂还依赖进口，购买周 期长，这就会迫使实验中途停止，致使实验效率严重降低，有的实验不能中途停顿，就可能 使整个实验全部失败。我们建议实验人员在做分子生物学实验之前，应在基础知识、实验方 法、实验材料及实验试剂上有充分的准备，在实验时间上做好充分的安排，以保证实验的顺 利开展。 5．侥幸心理 侥幸心理是基因工程实验中致使实验人员犯错误最多的原因，想省时间、省步骤及因对 前一步实验盲目自信是产生这种心理的主要原因。因为基因工程实验方法是在依据分子生物 学基础理论的基础上，辅以前人大量的实验经验而建立的，实验条件的细小改变，不一定会 使实验失败，但几个步骤的细小改变，累积起来必出大错。做基因工程实验每个步骤的结果， 在能够检测的条件下都应检测，否则不应进入下一步实验。由于各种原因，实验人员经常省 略检测这一步，从表面看省了事，实际上使后面的实验失去了保证，最后实验失败且连原因

都找不出，对重做实验也无补益。结果是花费更多的时间，还浪费了宝贵的样品和试剂。例如某人从克隆载体上分离基因，限制性内切酶酶切后没有检测是否切动、是否完全，即进入电泳分离基因，电泳完在紫外光下收割基因片段时，才看到载体DNA根本没有切断，只好重做。还有的人在前面的情况下，抱一种侥幸心理，认为可能会有少量基因切下，在基因DNA电泳应出现的位置割胶分离，将假想分离到的基因直接进行克隆。当然这些人的侥幸心理是有基础的，因为基因DNA分子太少，在EB染色中是看不到的，但这样做实验成功的机会甚微从我们实验室统计的情况看，花的时间成倍地多。总之，侥幸心理是导致实验失败最大的原因，是实验人员最总讳的事，所有的人都应加以杜绝。我们建议实验人员充分安排好实验，严格按照每一实验步骤的要求操作。当实验中出现没有把握的情况时，应停止实验，寻找原因加以克服，或找有经验的同行来解决问题，直到有把握再进入下一步实验。我们之所以在这里一再强调这一点，是因为在这方面犯错误的人太多太多，有经验的和没经验的人都不例外。（二）操作问题在基因工程实验中，经常要进行微生物学方面、生物化学方面及仪器方面等等的操作，不解这些操作的要求，也会影响实验人员的实验工作，甚至可能使实验室造成重大损失，所以每个实验人员进入实验室时，必须参阅有关的书籍，或请有经验的人员演示说明，方可开展实验。另外要着重说明的一点是做标签，由于实验室做实验的人员通常都很多，每人自己的样品较易与他人的样品混淆，自己的样品之间太多时也易混淆：许多样品需要保存的时间较长，到时可能找不到，所以手头的样品、试剂应随手标好。标签应写明样品名称、日期和配制人姓名，应牢靠、不能模糊。（三）试剂问题在基因工程实验中，要用到多种试剂，并且对试剂的要求十分严格，主要表现为：1，试剂等级不够，如应该用分析纯的误用了化学纯；2．试剂配制不当，如有的化学试剂结晶体，含有水分子，在称量时没有扣除它的份额，配制的试剂浓度过低；3.除菌条件不对，某些试剂应过滤除菌，另一些试剂应高温高压灭菌；4.试剂污染，如称量时，取用试剂时，别人污染时都可能造成污染；5.试剂储存时间过长，如测序用的丙烯酰胺胶母液，在4℃条件下只能存放一个月；6.试剂保存不当，如有的试剂应保存在-20℃下，另一些试剂则只能在室温下保存。所以实验人员在配制试剂时，要严格按各个特定试剂的配制要求来操作。（四）背景知识问题第一是对研究课题的背景知识了解不够。实验人员不知道实验要解决何种问题，怎样解决问题，不知道采用何种技术路线最有效地解决问题，这一现象是够严重的；第二是对具体IⅢI

III 都找不出，对重做实验也无补益。结果是花费更多的时间，还浪费了宝贵的样品和试剂。例 如某人从克隆载体上分离基因，限制性内切酶酶切后没有检测是否切动、是否完全，即进入 电泳分离基因，电泳完在紫外光下收割基因片段时，才看到载体 DNA 根本没有切断，只好重 做。还有的人在前面的情况下，抱一种侥幸心理，认为可能会有少量基因切下，在基因 DNA 电 泳应出现的位置割胶分离，将假想分离到的基因直接进行克隆。当然这些人的侥幸心理是有 基础的，因为基因 DNA 分子太少，在 EB 染色中是看不到的，但这样做实验成功的机会甚微， 从我们实验室统计的情况看，花的时间成倍地多。总之，侥幸心理是导致实验失败最大的原 因，是实验人员最忌讳的事，所有的人都应加以杜绝。我们建议实验人员充分安排好实验， 严格按照每一实验步骤的要求操作。当实验中出现没有把握的情况时，应停止实验，寻找原 因加以克服，或找有经验的同行来解决问题，直到有把握再进入下一步实验。我们之所以在 这里一再强调这一点，是因为在这方面犯错误的人太多太多，有经验的和没经验的人都不例 外。 (二)操作问题 在基因工程实验中，经常要进行微生物学方面、生物化学方面及仪器方面等等的操作， 不解这些操作的要求，也会影响实验人员的实验工作，甚至可能使实验室造成重大损失，所 以每个实验人员进入实验室时，必须参阅有关的书籍，或请有经验的人员演示说明，方可开 展实验。另外要着重说明的一点是做标签，由于实验室做实验的人员通常都很多，每人自己 的样品较易与他人的样品混淆， 自己的样品之间太多时也易混淆；许多样品需要保存的时 间较长，到时可能找不到，所以手头的样品、试剂应随手标好。标签应写明样品名称、日期 和配制人姓名，应牢靠、不能模糊。 (三)试剂问题 在基因工程实验中，要用到多种试剂，并且对试剂的要求十分严格，主要表现为：1，试 剂等级不够，如应该用分析纯的误用了化学纯；2．试剂配制不当，如有的化学试剂结晶体， 含有水分子，在称量时没有扣除它的份额，配制的试剂浓度过低；3．除菌条件不对，某些试 剂应过滤除菌，另一些试剂应高温高压灭菌；4．试剂污染，如称量时，取用试剂时，别人污 染时都可能造成污染；5．试剂储存时间过长，如测序用的丙烯酰胺胶母液，在 4℃条件下只 能存放一个月；6．试剂保存不当，如有的试剂应保存在-20℃下，另一些试剂则只能在室温 下保存。所以实验人员在配制试剂时，要严格按各个特定试剂的配制要求来操作。 (四)背景知识问题 第一是对研究课题的背景知识了解不够。实验人员不知道实验要解决何种问题，怎样解 决问题，不知道采用何种技术路线最有效地解决问题，这一现象是够严重的；第二是对具体

的实验原理不懂，以至不能正确地分析实验现象，不能灵活地解决实验中遇到的问题。我们建议实验人员尽可能多地占有有关课题的背景资料，详细地阅读和理解有关的实验资料（五）安全问题在生物实验中，实验人员经常要接触到一些对人体有害的实验试剂，如溴化乙锭（EB）、内烯酰胺等，它们或者可能诱发癌症，或者对人神经系统产生累积毒害。因此，为了实验人员的人身安全，每一个人都应严格按照实验安全操作的有关要求进行操作。另一个问题是，实验室经常要使用酒精、有机溶剂、水及电器，有可能导致爆炸或人员中毒死亡，实验室水龙头未关，下水道堵塞造成实验室水灾，实验室人员触电等时有发生，所以每一个实验人员在离开实验室时都应注意检查水、电、煤气，有关用电设备都应按操作说明使用，以防止不必要的人身意外伤亡。IV

IV 的实验原理不懂，以至不能正确地分析实验现象，不能灵活地解决实验中遇到的问题。我们 建议实验人员尽可能多地占有有关课题的背景资料，详细地阅读和理解有关的实验资料。 (五)安全问题 在生物实验中，实验人员经常要接触到一些对人体有害的实验试剂，如溴化乙锭（EB）、 丙烯酰胺等，它们或者可能诱发癌症，或者对人神经系统产生累积毒害。因此，为了实验人 员的人身安全，每一个人都应严格按照实验安全操作的有关要求进行操作。另一个问题是， 实验室经常要使用酒精、有机溶剂、水及电器，有可能导致爆炸或人员中毒死亡，实验室水 龙头未关，下水道堵塞造成实验室水灾，实验室人员触电等时有发生，所以每一个实验人员 在离开实验室时都应注意检查水、电、煤气，有关用电设备都应按操作说明使用，以防止不 必要的人身意外伤亡

目录第一篇基因工程制药综合实验实验一SIX1基因的PCR扩增反应实验二水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA11实验三DNA的重组连接14实验四重组质粒的转化18实验五转化子DNA的快速提取22实验六重组转化子的PCR鉴定24第二篇细胞工程制药综合实验26实验一细胞培养26实验二PEI转染动物细胞28实验三动物细胞蛋白的提取方法.31实验四蛋白浓度测定方法32实验五SDS-PAGE电泳33实验六WESTERNBLOT检测35第三篇酶工程制药综合实验41高产淀粉酶菌株的筛选41V

V 目 录 第一篇 基因工程制药综合实验. 7 实验一 基因的 PCR 扩增反应. 8 实验二 水平式琼脂糖凝胶电泳法检测 DNA. 11 实验三 DNA 的重组连接. 14 实验四 重组质粒的转化 . 18 实验五 转化子 DNA 的快速提取. 22 实验六 重组转化子的 PCR 鉴定. 24 第二篇 细胞工程制药综合实验. 26 实验一 细胞培养. 26 实验二 PEI 转染动物细胞 . 28 实验三 动物细胞蛋白的提取方法 . 31 实验四 蛋白浓度测定方法. 32 实验五 SDS-PAGE 电泳. 33 实验六 WESTERN BLOT 检测 . 35 第三篇 酶工程制药综合实验. 41 高产淀粉酶菌株的筛选 . 41

第四篇沙棘粗多糖的提取、纯化及鉴定45第五篇免疫组织化学检测48第六篇发酵罐说明及使用.51实验一气升式生化反应器的应用51实验二中试发酵设备的使用方法53附录发酵罐的简介....56VI

VI 第四篇 沙棘粗多糖的提取、纯化及鉴定. 45 第五篇 免疫组织化学检测. 48 第六篇 发酵罐说明及使用. 51 实验一 气升式生化反应器的应用 . 51 实验二 中试发酵设备的使用方法 . 53 附录 发酵罐的简介. 56

第一篇基因工程制药综合实验SIX1重组质粒的构建及蛋白表达质粒（Plasmid）是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子（即细胞附殖粒、又胞附殖粒）。它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中乃至于植物的线粒体等细胞器中。质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。大部分的质粒都是环状构型，然而目前也发现少数的线性质粒；天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。质粒的拷贝数（copynumber）在细胞里从单一到数千都有可能。有时有些质粒含有某种抗药基因（如大肠杆菌中就有含有抗四环素基因的质粒）。有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代谢能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。它是基因工程最常见的运载体。近几十年来，由于分子生物学的发展，人们利用质粒融合技术的频率越来越高，作为一种成熟的分子生物学实验技术，构建质粒成为一种越来越普及的基础而重要的方法。质粒构建技术是基因工程常用的技术之一，即是将一段需要的外源DNA（特异片段或全长片段）插入到载体质粒中形成重组DNA，然后将该重组DNA转运到宿主细胞中。常规的质粒构建方法是在插入片段和载体两端分别寻找相同的酶切位点，即双酶切后可以产生相同的粘性未端。当前还有In-Fusion融合方法，此方法的先进之处在于连接时间从常规方法的16～18hr缩短到15min，大大缩短了试验时间，提高了实验效率。Six1作为一个重要的调控基因，其表达产物参与肿瘤细胞的迁移和扩散，研究者发现，SIX1过表达的现象在多种癌细胞中表现，如在乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌等一些女性癌症中表现出Six1过表达。同时SIX1和EYA结合也表现出介导癌细胞迁移的功能，靶向SIX1或SIX1-EYA将可能成为一个有前景的癌症治疗目标。本实验以构建表达Six1蛋白基因工程菌为目的，通过PCR技术、酶切、链接等方法获取重组质粒，再用Westernblot法检测SIXl目的蛋白，以此确定SIX1目的蛋白被正确表达，本实验以DH5α大肠杆菌为宿主构建重组子，鉴定成功后提取质粒并转化BL21，构建含有BL21-pET28a-SIX1基因工程菌，经过菌落PCR等方法进行验证。7

7 第一篇 基因工程制药综合实验 SIX1 重组质粒的构建及蛋白表达 质粒（Plasmid）是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区 DNA 原有的能够自主复制的 较小的 DNA 分子（即细胞附殖粒、又胞附殖粒）。它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中， 乃至于植物的线粒体等细胞器中。质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以 同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。大部分的质粒都是环状构型，然而目前也发现少数 的线性质粒；天然质粒的 DNA 长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。质粒的拷贝数（copy number）在细胞里从单一到数千都有可能。有时有些质粒含有某种抗药基因（如大肠杆菌中 就有含有抗四环素基因的质粒）。有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代谢能 力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有 决定性的作用。它是基因工程最常见的运载体。 近几十年来,由于分子生物学的发展,人们利用质粒融合技术的频率越来越高，作为一种 成熟的分子生物学实验技术，构建质粒成为一种越来越普及的基础而重要的方法。 质粒构建技术是基因工程常用的技术之一，即是将一段需要的外源 DNA（特异片段或全 长片段）插入到载体质粒中形成重组 DNA，然后将该重组 DNA 转运到宿主细胞中。常规的 质粒构建方法是在插入片段和载体两端分别寻找相同的酶切位点，即双酶切后可以产生相同 的粘性末端。当前还有 In-Fusion 融合方法，此方法的先进之处在于连接时间从常规方法的 16～18hr 缩短到 15min，大大缩短了试验时间，提高了实验效率。 Six1 作为一个重要的调控基因，其表达产物参与肿瘤细胞的迁移和扩散，研究者发现， SIX1 过表达的现象在多种癌细胞中表现，如在乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌等一些女性癌症中表 现出 Six1 过表达。同时 SIX1 和 EYA 结合也表现出介导癌细胞迁移的功能，靶向 SIX1 或 SIX1-EYA 将可能成为一个有前景的癌症治疗目标。本实验以构建表达 Six1 蛋白基因工程菌 为目的，通过 PCR 技术、酶切、链接等方法获取重组质粒，再用 Western blot 法检测 SIX1 目的蛋白，以此确定 SIX1 目的蛋白被正确表达， 本实验以 DH5α 大肠杆菌为宿主构建重组子，鉴定成功后提取质粒并转化 BL21，构建含 有 BL21-pET28a-SIX1 基因工程菌，经过菌落 PCR 等方法进行验证

实验一SIX1基因的PCR扩增反应一、实验目的1.学习PCR反应的基本原理与实验技术。2.了解引物设计的一般要求。二、实验原理单链DNA在互补寡聚核苷酸片段的引导下，可以利用DNA多聚酶按5'→3方向复制出互补DNA。这时单链DNA称为模板DNA，寡聚核苷酸片段称为引物（Primer），合成的互补DNA称为产物DNA。扩增后的双链DNA分子经高温变性后文成为两条单链DNA，它们都可作为模板DNA，在相应的引物引导下，用DNA聚合酶复制出各自互补的产物DNA。PCR反应应用以上的基本过程，分别在待复制的已知序列DNA分子两端各设计一条引物，其中在DNA5端的引物(P1)对应于上链DNA单链的序列，3°端的引物（P2)对应于下链DNA单链的序列，P1和P2按5'→3方向相向配置。在含有引物、DNA合成底物dNTPs（dATP、dCTP、dGTP、dTTP4种脱氧核糖核苷酸等摩尔数混合物）的缓冲液中，通过高温变性，使双链DNA变成单链DNA模板，降低温度复性，使引物与模板DNA配对，然后在一中间温度作用下，利用DNA聚合酶便可合成产物DNA。引物和dNTPs过量，则在同一反应体系中可重复高温变性、低温复性和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并且在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA参与DNA的合成，使产物DNA的量按2"方式扩增，所以这一反应称为链式扩增反应。理论上如果引物及dNTP的量足够，扩增过程无限重复，便可使模板DNA无限扩增。PCR反应使几个DNA模板分子通过数小时扩增后增加到百万倍以上，因此用微量的DNA样品不仅可获取目的基因，同时也完成了基因在体外的克隆。目前，PCR技术已成为分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。另外在医学研究和医疗诊断中亦也具有极大的应用价值。常规PCR反应用于已知DNA序列的扩增，反应循环数为25～35，变性温度为94℃。复性温度为37C～55℃（具体反应温度应根据引物的Tm值而决定），合成延伸温度为72℃，DNA聚台酶为Tag酶（可耐受95℃左右的高温而不失活)，DNA扩增倍数为1010%。引物的设计在PCR反应中极为重要。要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵守以下几条原则：①引物长度：15～25个核苷酸；②CG含量为40%～60%；③TM值高于55℃[TM=4(C十G)十2(A十T)计算]：④引物与模板非特异性配对位点的碱基配对率小于70%；③两条引物间配对碱基数小于5个；③避免引物内部形成二级结构，若引物自身配对（特别是在引物的3端形成茎环结构），茎的碱基对数不大于3。8

8 实验一 SIX1 基因的 PCR 扩增反应 一、实验目的 1．学习 PCR 反应的基本原理与实验技术。 2．了解引物设计的一般要求。 二、实验原理 单链 DNA 在互补寡聚核苷酸片段的引导下，可以利用 DNA 多聚酶按 5’→3’方向复制出 互补 DNA。这时单链 DNA 称为模板 DNA，寡聚核苷酸片段称为引物(Primer)，合成的互补 DNA 称为产物 DNA。扩增后的双链 DNA 分子经高温变性后又成为两条单链 DNA，它们都 可作为模板 DNA，在相应的引物引导下，用 DNA 聚合酶复制出各自互补的产物 DNA。PCR 反应应用以上的基本过程，分别在待复制的已知序列 DNA 分子两端各设计一条引物，其中 在 DNA 5’端的引物(P1)对应于上链 DNA 单链的序列，3’端的引物(P2)对应于下链 DNA 单链 的序列，P1 和 P2 按 5’→3’方向相向配置。在含有引物、DNA 合成底物 dNTPs (dATP、dCTP、 dGTP、dTTP4 种脱氧核糖核苷酸等摩尔数混合物)的缓冲液中，通过高温变性，使双链 DNA 变成单链 DNA 模板，降低温度复性，使引物与模板 DNA 配对，然后在一中间温度作用下， 利用 DNA 聚合酶便可合成产物 DNA。引物和 dNTPs 过量，则在同一反应体系中可重复高温 变性、低温复性和 DNA 合成这—循环，使产物 DNA 重复合成，并且在重复过程中，前一循 环的产物 DNA 可作为后一循环的模板 DNA 参与 DNA 的合成，使产物 DNA 的量按 2 n方式 扩增，所以这一反应称为链式扩增反应。理论上如果引物及 dNTP 的量足够，扩增过程无限 重复，便可使模板 DNA 无限扩增。PCR 反应使几个 DNA 模板分子通过数小时扩增后增加到 百万倍以上，因此用微量的 DNA 样品不仅可获取目的基因，同时也完成了基因在体外的克 隆。目前，PCR 技术已成为分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。另外在医学研究 和医疗诊断中亦也具有极大的应用价值。 常规 PCR 反应用于已知 DNA 序列的扩增，反应循环数为 25～35，变性温度为 94℃。复 性温度为 37C～55℃（具体反应温度应根据引物的 Tm 值而决定），合成延伸温度为 72℃， DNA 聚台酶为 Taq 酶(可耐受 95℃左右的高温而不失活)，DNA 扩增倍数为 106～109。 引物的设计在 PCR 反应中极为重要。要保证 PCR 反应能准确、特异、有效地对模板 DNA 进行扩增，通常引物设计要遵守以下几条原则：①引物长度：15～25 个核苷酸；②CG 含量 为 40％～60％；③TM 值高于 55℃ [TM＝4(C 十 G)十 2(A 十 T)计算]；④引物与模板非特异 性配对位点的碱基配对率小于 70％；⑤两条引物间配对碱基数小于 5 个；⑥避免引物内部形 成二级结构，若引物自身配对(特别是在引物的 3’端形成茎环结构)，茎的碱基对数不大于 3

由于影响引物的设计的因素比较多，所以常常利用计算机来辅助设计，现开发出的计算机软件还不太多，我们通常都用primer5软件以及NCBI网站上设计、修改引物。三、材料和仪器PCR仪，台式离心机，移液器（0.1-2.5uL），200uLPCR管，吸头，离心管，手套，制冰机，微量移液器（10、100μL量程各一支）。PCRmix（内含Taq酶，dNTP，缓冲液等），10×buffer(PCR缓冲液）上游引物，下游引物；模板DNA（Mr203850质粒购自OriGene）；ddHO。*SIX1的cDNA序列（249-1103，854bp）：Atgtcgatgc gccgtcgtttggctttacgcaggagcaagtggcgtgcgtgtgcgaggttctgcagcaaggcggaaacctGgagcgcct gggcaggttcctgtggtcactgcccgcctgcgaccacctgcacaagaacgagagcgtactcaaggccaaggcggtggtcgccttccaccgcggcaacttccgtgagctctacaagatcctggagagccaccagttctcgcctcacaaccaccccaaactgcagcaactgtggctgaaggcgcattacgtggaggccgagaagctgcgcggccgacccctgggcgccgtgggcaaatatcgggtgcgccgaaaattccactgccgcgcaccatctgggacggcgaggagaccagctactgcttcaaggagaagtcgaggggtgtcctgcgggagtggtacgcgcacaatccctacccatcgccgcgtgagaagcgggagctggccgaggccaccggcctcaccaccacccaggtcagcaactggtttaagaaccggaggcaaagagaccgggccgcggaggccaaggaaagggagaacaccgaaaacaataactcctcctccaacaagcagaaccaactctctcctctggaagggggcaagccgctcatgtccagctcagaagaggaattctcacctccccaaagtccagaccagaactcggtccttctgctgcagggcaatatgggccacgccaggagctcaaactattctctcccgggcttaacagcctcgcagcccagtcacggcctgcagacccaccagcatcagctccaagactctctgctcggccccctcacctccagtctggtggacttggggtcctaa多肽序列：1msmlpsfgft qeqvacvcev lqqggnlerl grflwslpac dhlhknesvl kakavvafhr61 gnfrelykil eshqfsphnh pklqqlwlkahyveaeklrg rplgavgkyr vrrkfplprt121 iwdgeetsyc fkeksrgvlr ewyahnpyps prekrelaea tgltttqvsn wfknrrqrdr181 aaeakerent ennnsssnkq nqlspleggk plmssseeef sppqspdqns vlllqgnmgh241 arssnyslpg Itasqpshglqthqhqlqds llgpltsslvdlgs试根据上述序列及设计原则为本实验设计引物序列：上游引物：下游引物：四、实验操作1.准备PCR反应溶液

9 由于影响引物的设计的因素比较多，所以常常利用计算机来辅助设计，现开发出的计算机软 件还不太多，我们通常都用 primer5 软件以及 NCBI 网站上设计、修改引物。 三、材料和仪器 PCR 仪，台式离心机，移液器（0.1-2.5 μL），200 μL PCR 管，吸头，离心管，手套，制 冰机，微量移液器（10、100 μL 量程各一支）。 PCRmix（内含 Taq 酶，dNTP，缓冲液等），. 10×buffer (PCR 缓冲液) 上游引物，下游引物；模板 DNA（Mr203850 质粒购自 OriGene）； ddH2O。 *SIX1 的 cDNA 序列（249-1103，854bp）： Atgtcgatgc gccgtcgtttggctttacgcaggagcaagtggcgtgcgtgtgcgaggttctgcagcaaggcggaaacct Ggagcgcct gggcaggttcctgtggtcactgcccgcctgcgaccacctgcacaagaacgagagcgtactcaaggccaagg cggtggtcgccttccaccgcggcaacttccgtgagctctacaagatcctggagagccaccagttctcgcctcacaaccac cccaaactgcagcaactgtggctgaaggcgcattacgtggaggccgagaagctgcgcggccgacccctgggcgccgtggg caaatatcgggtgcgccgaaaatttccactgccgcgcaccatctgggacggcgaggagaccagctactgcttcaaggaga agtcgaggggtgtcctgcgggagtggtacgcgcacaatccctacccatcgccgcgtgagaagcgggagctggccgaggcc accggcctcaccaccacccaggtcagcaactggtttaagaaccggaggcaaagagaccgggccgcggaggccaaggaaag ggagaacaccgaaaacaataactcctcctccaacaagcagaaccaactctctcctctggaagggggcaagccgctcatgt ccagctcagaagaggaattctcacctccccaaagtccagaccagaactcggtccttctgctgcagggcaatatgggccac gccaggagctcaaactattctctcccgggcttaacagcctcgcagcccagtcacggcctgcagacccaccagcatcagct ccaagactctctgctcggccccctcacctccagtctggtggacttggggtcctaa 多肽序列： 1 msmlpsfgft qeqvacvcev lqqggnlerl grflwslpac dhlhknesvl kakavvafhr 61 gnfrelykil eshqfsphnh pklqqlwlka hyveaeklrg rplgavgkyr vrrkfplprt 121 iwdgeetsyc fkeksrgvlr ewyahnpyps prekrelaea tgltttqvsn wfknrrqrdr 181 aaeakerent ennnsssnkq nqlspleggk plmssseeef sppqspdqns vlllqgnmgh 241 arssnyslpg ltasqpshgl qthqhqlqds llgpltsslv dlgs 试根据上述序列及设计原则为本实验设计引物序列： 上游引物： 下游引物： 四、实验操作 1. 准备 PCR 反应溶液