《结构免疫学》课程教学资源（实验室SOP）3 蛋白生化与生物物理技术

3.蛋白生化与生物物理技术3蛋白生化与生物物理技术3.1蛋白质表达系统3.1.1E.coli蛋白表达系统3.1.2哺乳动物表达系统3.1.3昆虫表达系统3.1.4硒代蛋白表达3.2蛋白纯化技术3.2.1AKTA使用规则及使用实例3.2.2蛋白纯化柱子的介绍及清洁方法3.2.3透析袋的使用3.2.4浓缩管的使用3.2.5TEV蛋白酶的使用3.2.6金属螯合层析3.2.7分子筛3.2.8疏水作用层析3.2.9离子交换层析3.2.10ProteinA/G纯化抗体3.2.11谷胱甘肽转移酶（GST)亲和层析3.2.12Fab的蛋白表达3.2.13植物种子蛋白的提取方案3.2.14包涵体复性3.2.15SDS-PAGE凝胶电泳3.2.16GraphPadPrism软件的使用3.3筛选与蛋白互作的分子3.3.1酵母双杂交技术从文库中筛选与蛋白X结合的蛋白3.3.2噬菌体展示3.3.3配体指数富集的系统进化技术筛选核酸适配体3.4检测蛋白与互作分子的互作3.4.1酵母双杂交Yeasttwohybrid3.4.2双分子荧光互补Bimolecularfluorescencecomplementation3.4.3 Western Blotting3.4.4免疫共沉淀Co-lmmunoprecipitation3.4.5差示扫描荧光技术DifferentialScanningFluorimetry3.4.6荧光偏振Fluorescencepolarization3.4.7等温滴定微量热lsothermalTitrationCalorimetry

3. 蛋白生化与生物物理技术 3 蛋白生化与生物物理技术 3.1蛋白质表达系统 3.1.1 E. coli蛋白表达系统 3.1.2哺乳动物表达系统 3.1.3昆虫表达系统 3.1.4硒代蛋白表达 3.2蛋白纯化技术 3.2.1 AKTA使用规则及使用实例 3.2.2蛋白纯化柱子的介绍及清洁方法 3.2.3透析袋的使用 3.2.4浓缩管的使用 3.2.5 TEV蛋白酶的使用 3.2.6金属螯合层析 3.2.7分子筛 3.2.8疏水作用层析 3.2.9离子交换层析 3.2.10 Protein A/G 纯化抗体 3.2.11谷胱甘肽转移酶 (GST) 亲和层析 3.2.12 Fab的蛋白表达 3.2.13植物种子蛋白的提取方案 3.2.14包涵体复性 3.2.15 SDS-PAGE凝胶电泳 3.2.16 GraphPad Prism软件的使用 3.3筛选与蛋白互作的分子 3.3.1酵母双杂交技术从文库中筛选与蛋白X结合的蛋白 3.3.2噬菌体展示 3.3.3配体指数富集的系统进化技术筛选核酸适配体 3.4检测蛋白与互作分子的互作 3.4.1酵母双杂交 Yeast two hybrid 3.4.2双分子荧光互补Bimolecular fluorescence complementation 3.4.3 Western Blotting 3.4.4免疫共沉淀Co-Immunoprecipitation 3.4.5差示扫描荧光技术Differential Scanning Fluorimetry 3.4.6荧光偏振Fluorescence polarization 3.4.7等温滴定微量热Isothermal Titration Calorimetry

3.4.8表面等离子共振技术Biacore3.4.9蛋白质交联Crosslink3.4.10Native-PAGE3.4.11静态光散射Staticlightscattering3.4.12凝胶阻滞实验EMSA-electrophoreticmobilityshiftassay3.5蛋白生化实验技术3.5.1蛋白酶活性检测3.5.2ATP酶活检测3.5.3解旋酶活性检测3.5.4体外转录实验3.1蛋白质表达系统3.1.1E.coli蛋白表达系统蛋白的原核表达是指用细菌（例如大肠杆菌）表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术。原核表达的优点主要在宿主菌生长较快，易于操作，产量较高等。对于结构生物学这类需要大量蛋白质的学科来说比较适用。常用的大肠杆菌表达系统大多采用T7promoter，它可以结合Lacoperon和Araoperon的元件，对其控制的基因表达做调控。通常目的蛋白的表达可以通过添加诱导剂来实现，本实验室常用诱导剂为IPTG，但也有用四环素和阿拉伯糖诱导原核表达系统。本实验室常用的表达菌株有BL21（DE3），Rosetta，CodonPlusRIPL等。常用的表达载体有V29H，V28E，V30，V55等。不同载体运用的蛋白表达方法不同，所以应根据不同载体的特点选择合适的表达菌株和诱导剂。更多表达载体的信息详见载体部分。3.1.1.1E.coli蛋白表达检测简介（INTRODUCTION）原核小规模表达测试是大规模蛋白表达前的预实验，只有小规模测试中能够成功表达目的蛋白的克隆才能用于大规模的蛋白表达。此处以小规模蛋白表达检测为例（大规模蛋白表达类同小规模表达，不同的是前者所用培养基的用量以升为单位）。材料（MATERIALS）口试剂（REAGENTS）无抗性液体培养基（包含试管装5mL液体培养基）、含抗生素固体培养基、抗生素（视载体情况而定）、诱导剂（1MIPTG）、60%甘油（使用前需灭菌）、SDS-Loading、考马斯亮蓝。实验步骤（PROCEDURE）1.第一天：转化重组质粒至表达菌株，37℃C培养箱过夜培养16h。2.第二天：挑单克隆于5mL抗性培养基（一般一种菌株挑取2-5个单克隆），37C摇床培养至OD600=1.2（大约5小时）。1）保菌：在超净台台中取菌液和甘油相同体积于冻存管（使甘油终浓度在20%~30%之间，例如0.5mL菌液+0.5mL60%甘油），混匀后放入-80C冰箱中保存。2）对照：从试管中分别吸取1mL菌液至2mL离心管中，不加诱导剂，16C摇床中诱导约3小时。3）诱导：从试管中分别吸取1mL菌液至2mL离心管中，加入适量诱导剂（常为1μL1MIPTG，其他诱导剂用量请参见其使用说明书，16°C摇床中诱导约3小时。3.SDS-PAGE检测

3.4.8表面等离子共振技术Biacore 3.4.9蛋白质交联Crosslink 3.4.10 Native-PAGE 3.4.11静态光散射Static light scattering 3.4.12凝胶阻滞实验EMSA-electrophoretic mobility shift assay 3.5蛋白生化实验技术 3.5.1蛋白酶活性检测 3.5.2 ATP酶活检测 3.5.3解旋酶活性检测 3.5.4体外转录实验 3.1 蛋白质表达系统 3.1.1 E. coli蛋白表达系统 蛋白的原核表达是指用细菌（例如大肠杆菌）表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术。原核表达的 优点主要在宿主菌生长较快，易于操作，产量较高等。对于结构生物学这类需要大量蛋白质的学科来说比 较适用。 常用的大肠杆菌表达系统大多采用T7 promoter，它可以结合Lac operon和Ara operon的元件，对其控制 的基因表达做调控。通常目的蛋白的表达可以通过添加诱导剂来实现，本实验室常用诱导剂为IPTG，但 也有用四环素和阿拉伯糖诱导原核表达系统。本实验室常用的表达菌株有BL21（DE3），Rosetta，Codon Plus RIPL等。常用的表达载体有V29H，V28E，V30，V55等。不同载体运用的蛋白表达方法不同，所以 应根据不同载体的特点选择合适的表达菌株和诱导剂。更多表达载体的信息详见载体部分。 3.1.1.1 E. coli蛋白表达检测 简介（INTRODUCTION） 原核小规模表达测试是大规模蛋白表达前的预实验，只有小规模测试中能够成功表达目的蛋白的克 隆才能用于大规模的蛋白表达。此处以小规模蛋白表达检测为例（大规模蛋白表达类同小规模表达，不同 的是前者所用培养基的用量以升为单位）。 材料（MATERIALS） r 试剂（REAGENTS） 无抗性液体培养基（包含试管装5 mL液体培养基）、含抗生素固体培养基、抗生素（视载体情况而 定）、诱导剂（1 M IPTG）、60%甘油（使用前需灭菌）、SDS-Loading、考马斯亮蓝。 实验步骤（PROCEDURE） 1. 第一天：转化重组质粒至表达菌株，37 °C培养箱过夜培养16 h。 2. 第二天：挑单克隆于5 mL抗性培养基（一般一种菌株挑取2-5个单克隆），37 °C摇床培养至OD600 =1.2 （大约5小时）。 1) 保菌：在超净台台中取菌液和甘油相同体积于冻存管（使甘油终浓度在20%~30%之间，例如0.5 mL菌液+0.5 mL 60%甘油），混匀后放入-80 °C冰箱中保存。 2) 对照：从试管中分别吸取1 mL菌液至2 mL离心管中，不加诱导剂，16 °C摇床中诱导约3小时。 3) 诱导：从试管中分别吸取1 mL菌液至2 mL离心管中，加入适量诱导剂（常为1 μL 1 M IPTG，其他 诱导剂用量请参见其使用说明书），16 °C摇床中诱导约3小时。 3. SDS-PAGE检测

1）诱导组和对照组的菌液，5000rpm离心5min，弃上清（此时可以打开煮样器，让其升温）。2）每管加入100μLddH2O重悬，并加入SDS-loading至1×，混匀，煮样器中煮10~20min。3）12000rpm离心10min（此时可以将蛋白电泳装置准备好）。4）将离心好的样品取上清按照未诱导、诱导、未诱的方式对应跑胶。5）对成功诱导的克隆进行-80C冰箱甘油保存。：2614蛋白表达诱导SDS-PAGE检测结果。UI：未诱导，I：诱导。针对性建议（TROUBLESHOOTING）1.尽量不要在冰箱中冻存过多的表达/克隆菌，节约公共资源。2．实验室常用的抗生素有Kan和Amp，具体抗性视载体情况而定，例如V28E、V29H等载体抗KanV55、V137、V138等载体抗Amp；并不是所有载体都用IPTG诱导，使用前需要查看相关说明书。3.若重复若干次实验，目的蛋白的小规模表达均不理想，可以考虑更换载体或表达菌株再进行小规模诱导检测；4.若想确定蛋白表达是在包涵体中还是上清，可以从诱导成功的冻存菌中再接种表达菌进行诱导表达，诱导结束后离心菌液取沉淀，加入缓冲液后进行超声破碎，再次离心分别取上清液和沉淀制样，通过SDS-PAGE检测以确定表达的情况。5.对于一些特殊性质或较难表达的蛋白，可尝试不同的表达菌株，例如AI可用于表达毒性蛋白，Rosetta、RIP、RIPL常用于表达哺乳动物蛋白（含有稀有密码子）。3.1.1.2E.coli大规模蛋白表达简介（INTRODUCTION）蛋白质是行使用生物学功能的最重要的一类分子。利用生物化学、生物物理，特别是结构生物学等手段对蛋白质进行研究，需要大量的高纯度的蛋白。利用异源表达宿主来表达重组蛋白是目前最常用的一种方式。蛋白表达纯化系统有很多种，比较常用的有原核表达系统（大肠杆菌）和真核表达系统（如酵母、昆虫细胞或者哺乳动物细胞）。不同的表达系统各有优缺点，而不同的蛋白对表达系统的要求也不同。这里仅介绍大肠杆菌表达系统。材料（MATERIALS）口试剂（REAGENTS）LB培养基、抗生素（根据载体抗性而定）、1MIPTG、50%葡萄糖、2MMgSO4口实验前准备（SETUP）清洗2L的摇菌烧瓶；清洗若干个50mL离心管（灭菌后用于接菌）口器械（EQUIPMENT）摇床、超净台、高压灭菌锅实验步骤（PROCEDURE）

1) 诱导组和对照组的菌液，5000 rpm离心5 min，弃上清（此时可以打开煮样器，让其升温）。 2) 每管加入100 μL ddH2O重悬，并加入SDS-loading至1×，混匀，煮样器中煮10~20 min。 3) 12000 rpm离心10 min（此时可以将蛋白电泳装置准备好）。 4) 将离心好的样品取上清按照未诱导、诱导、未诱的方式对应跑胶。 5) 对成功诱导的克隆进行-80 °C冰箱甘油保存。 针对性建议（TROUBLESHOOTING） 1. 尽量不要在冰箱中冻存过多的表达/克隆菌，节约公共资源。 2. 实验室常用的抗生素有Kan和Amp，具体抗性视载体情况而定，例如V28E、V29H等载体抗Kan， V55、V137、V138等载体抗Amp；并不是所有载体都用IPTG诱导，使用前需要查看相关说明书。 3. 若重复若干次实验，目的蛋白的小规模表达均不理想，可以考虑更换载体或表达菌株再进行小规模诱 导检测； 4. 若想确定蛋白表达是在包涵体中还是上清，可以从诱导成功的冻存菌中再接种表达菌进行诱导表达， 诱导结束后离心菌液取沉淀，加入缓冲液后进行超声破碎，再次离心分别取上清液和沉淀制样，通过 SDS-PAGE检测以确定表达的情况。 5. 对于一些特殊性质或较难表达的蛋白，可尝试不同的表达菌株，例如AI可用于表达毒性蛋白， Rosetta、RIP、RIPL常用于表达哺乳动物蛋白（含有稀有密码子）。 3.1.1.2 E. coli大规模蛋白表达 简介（INTRODUCTION） 蛋白质是行使用生物学功能的最重要的一类分子。利用生物化学、生物物理，特别是结构生物学等手 段对蛋白质进行研究，需要大量的高纯度的蛋白。利用异源表达宿主来表达重组蛋白是目前最常用的一种 方式。 蛋白表达纯化系统有很多种，比较常用的有原核表达系统（大肠杆菌）和真核表达系统（如酵母、昆 虫细胞或者哺乳动物细胞）。不同的表达系统各有优缺点，而不同的蛋白对表达系统的要求也不同。这里 仅介绍大肠杆菌表达系统。 材料（MATERIALS） r 试剂（REAGENTS） LB培养基、抗生素（根据载体抗性而定）、1 M IPTG、50%葡萄糖、2 M MgSO4 r 实验前准备（SETUP） 清洗2 L的摇菌烧瓶；清洗若干个50 mL离心管（灭菌后用于接菌） r 器械（EQUIPMENT） 摇床、超净台、高压灭菌锅 实验步骤（PROCEDURE）

1.配制LB：在大规模摇菌前一天配制LB，以5升LB培养基为例：称取50gNaCl、50g蛋白陈、25g酵母粉溶于自来水定容至5L。同时配制用于第二天大规模接菌的LB培养基：称取2.5gLURIABROTH（MillersLBBroth）溶于100mL纯水的烧瓶中。将上述LB培养基、50mL干净离心管、50%葡萄糖、2MMgSO4于高压灭菌锅121°C灭菌20min。2.在超净工作台中将小规模诱导成功的表达菌接种于100mLLB培养基中，并加入相应的抗生素，同时也可每升可添加1ml2MMgSO4和5ml50%无菌葡萄糖（促进细胞生长，抑制基础/漏表达），37C摇床内过夜摇菌。3.UV灭菌：在第二天大规模摇菌前打开大摇床的UV照射灭菌，同时将LB、灭菌后离心管、抗生素及所需枪头喷洒酒精后放入超净台内，打开UV照射灭菌20min。4.接菌：用无菌50mL离心管将过夜培养的菌液平分至5升LB中，并加入相应抗生素。5.摇菌：37C摇床内大规模摇菌至OD600值为1.2（约需3~4小时），然后调节温度至16，加IPTG诱导表达4h后于4℃落地离心机收菌，-80C冷藏。针对性建议（TROUBLESHOOTING）1.尽量不要使用甘油冻存菌直接接菌，建议重新划线LB平板然后挑取单克隆，以避免噬菌体污染和质粒丢失；2.根据蛋白表达量确定大规模摇菌体积，如果表达量很高的蛋白一般3L足够，而表达量低的蛋白可多摇至10或12L，一般情况下，我们需要纯化得到几毫克的蛋白用于结晶及后续相关实验用。3.由于大摇床降温速度较慢，提前开始降温至16C，冷却1h后再加入IPTG；诱导时间一般4小时足够，具体诱导时间长短，以获得最终有活性非聚合蛋白的量为准，诱导时间过长可能包涵体或聚合体产量大，也有可能发生蛋白降解。4.收菌前吸取30OμL菌液制备SDS-PAGE样品，纯化之前先鉴定蛋白表达与否。5.诱导的条件，比如时间和温度，可以根据需要进一步优化。3.1.1.3蛋白纯化简介（INTRODUCTION）蛋白质通过原核或者真核表达系统表达后是一种既有宿主蛋白也有目的蛋白的混合体，我们需要通过目的蛋白的特点去进行特异的筛选，把目的蛋白从混合体中分离出来。目前用的较多的一种方法就是金属离子亲和层析（也叫IMAC）的方法。在设计克隆时人为地在目的蛋白的N端或者C端加入6个或者更多连续的组氨酸，组氨酸可以与Ni2+，Cu2+，Co2+结合，再用高浓度的咪唑将目的蛋白洗脱下来。因此目前市场上常见的IMAC柱有三种：Ni柱，Cu柱以及Co柱。用于螯合这些金属离子的螯合剂有NTA（nitrilotriaceticacid，次氮基三乙酸）和IDA（iminodiaceticacid，亚氨基二乙酸）。所以我们实验室常用的Ni-NTA就是用NTA作为整合剂的Ni2+离子亲和柱。三种金属离子柱比较：结合强度特异性★Co2+柱★★★Ni2+柱★★★★Cu2+柱★★★★Co2+柱的结合能力最弱，因此其特异性最好，但损失也是最大的；Cu2+柱的结合能力最强，特异性是最差的，但是产量高，因此对于那些蛋白产量低的情况可以用于初筛；Ni2+柱介于中间。下面以Ni2+柱为例，介绍IMAC流程。材料（MATERIALS）口试剂（REAGENTS）Ni-Bindingbuffer:0.50MNaCl,16mMImidazole,20mMTris-HClpH8.0Elutionbuffer:0.50MNaCl,400mMImidazole，20mMTris-HClpH8.0Gelfiltrationbuffer:0.25MNaCl,10mMTris-HCIpH8.0口实验前准备（SETUP）

1. 配制LB：在大规模摇菌前一天配制LB，以5升LB培养基为例：称取50 g NaCl、50 g 蛋白胨、25 g 酵 母粉溶于自来水定容至5 L。同时配制用于第二天大规模接菌的LB培养基：称取2.5 g LURIA BROTH （Miller’s LB Broth）溶于100 mL纯水的烧瓶中。将上述LB培养基、50 mL干净离心管、50%葡萄糖、2 M MgSO4于高压灭菌锅121 °C灭菌20 min。 2. 在超净工作台中将小规模诱导成功的表达菌接种于100 mL LB培养基中，并加入相应的抗生素，同时也 可每升可添加1 ml 2M MgSO4和5 ml 50%无菌葡萄糖（促进细胞生长，抑制基础/漏表达），37 °C摇床内 过夜摇菌。 3. UV灭菌：在第二天大规模摇菌前打开大摇床的UV照射灭菌，同时将LB、灭菌后离心管、抗生素及所 需枪头喷洒酒精后放入超净台内，打开UV照射灭菌20 min。 4. 接菌：用无菌50 mL离心管将过夜培养的菌液平分至5升LB中，并加入相应抗生素。 5. 摇菌：37 °C摇床内大规模摇菌至OD600值为1.2（约需3~4小时），然后调节温度至16 °C，加IPTG诱 导表达4 h后于4 °C落地离心机收菌，-80 °C冷藏。 针对性建议（TROUBLESHOOTING） 1. 尽量不要使用甘油冻存菌直接接菌，建议重新划线LB平板然后挑取单克隆，以避免噬菌体污染和质粒 丢失； 2. 根据蛋白表达量确定大规模摇菌体积，如果表达量很高的蛋白一般3 L足够，而表达量低的蛋白可多摇 至10或12 L，一般情况下，我们需要纯化得到几毫克的蛋白用于结晶及后续相关实验用。 3. 由于大摇床降温速度较慢，提前开始降温至16 °C，冷却1 h后再加入IPTG；诱导时间一般4小时足够， 具体诱导时间长短，以获得最终有活性非聚合蛋白的量为准，诱导时间过长可能包涵体或聚合体产量大， 也有可能发生蛋白降解。 4. 收菌前吸取300 μL菌液制备SDS-PAGE样品，纯化之前先鉴定蛋白表达与否。 5. 诱导的条件，比如时间和温度，可以根据需要进一步优化。 3.1.1.3蛋白纯化 简介（INTRODUCTION） 蛋白质通过原核或者真核表达系统表达后是一种既有宿主蛋白也有目的蛋白的混合体，我们需要通过 目的蛋白的特点去进行特异的筛选，把目的蛋白从混合体中分离出来。目前用的较多的一种方法就是金属 离子亲和层析（也叫IMAC）的方法。在设计克隆时人为地在目的蛋白的N端或者C端加入6个或者更多连 续的组氨酸，组氨酸可以与Ni2+，Cu2+，Co2+结合，再用高浓度的咪唑将目的蛋白洗脱下来。 因此目前市场上常见的IMAC柱有三种：Ni柱，Cu柱以及Co柱。用于螯合这些金属离子的螯合剂有 NTA（nitrilotriacetic acid，次氮基三乙酸）和IDA（iminodiacetic acid，亚氨基二乙酸）。所以我们实验室 常用的Ni-NTA就是用NTA作为螯合剂的Ni2+离子亲和柱。 三种金属离子柱比较： 结合强度 特异性 Co2+柱 ★ ★★★ Ni2+柱 ★★ ★★ Cu2+柱 ★★★ ★ Co2+柱的结合能力最弱，因此其特异性最好，但损失也是最大的；Cu2+柱的结合能力最强，特异性 是最差的，但是产量高，因此对于那些蛋白产量低的情况可以用于初筛；Ni2+柱介于中间。 下面以Ni2+柱为例，介绍IMAC流程。 材料（MATERIALS） r 试剂（REAGENTS） Ni-Binding buffer：0.50 M NaCl，16 mM Imidazole，20 mM Tris-HCl pH 8.0 Elution buffer：0.50 M NaCl，400 mM Imidazole，20 mM Tris-HCl pH 8.0 Gel filtration buffer：0.25 M NaCl，10 mM Tris-HCl pH 8.0 r 实验前准备（SETUP）

buffer使用前在放在4C冰箱预冷，准备收集管，保证有足够的干净且已烘干的玻璃管口器械（EQUIPMENT）Thermo落地式离心机（使用前预冷至4°C），AKTAFPLC纯化仪，超声仪，抽滤泵实验步骤（PROCEDURE）以MBP融合表达蛋白为例：A.纯化蛋白——一次Ni亲和柱（详见3.2.6金属螯合层析章节）、破菌预计消耗时间：30min~1h1.将冻存在-80C冰箱的菌拿出来，放在水里解冻，根据细菌湿重每克5~10mL加入Ni-Bindingbuffer。解冻后把金属烧杯放在冰上，进行超声。对于不稳定的蛋白，可加入PMSF以防止蛋白降解。2.将烧杯至于冰水中进行超声破碎。液流不呈丝状时，说明已超声完全。3.用完后用水洗探头。关键步骤：口观察蛋白质纯化过程中蛋白质的降解和沉淀情况，当蛋白易降解时，可在所有缓冲液及蛋白收集。液中加入通用丝氨酸蛋白酶抑制剂（PMSF，终浓度0.5mM）抑制蛋白降解。离心、过滤预计消耗时间：40min1.将超声好的菌液平均倒入离心管中，配平好，放入已预冷至4C的落地式离心机。2.14000rpm离心20分钟，将上清倒入小烧杯中。3.组装好抽滤装置进行抽滤（注意不要漏，样品和滤瓶均要放在冰上）。、平衡Ni-NTA柱预计消耗时间：20min1.将N柱从4C冰箱取出，这时柱里面是20%酒精。2.限压0.4Mpa，流速3mL/min，水洗Ni柱10分钟。3.换成Ni-Bindingbuffer再洗10分钟，将Ni柱平衡好。上样使蛋白挂柱预计消耗时间：根据样品体积而定1．将Superloop和Ni柱都放在冰上，用洗好的绿色的连接管湿接Ni柱。2.蠕动泵流速设定为3mL/min，限压为0.4MPa。3.当样品流完一个柱体积时，用Ep管接流出的样品，标记好“firstflowthrough”。4.当样品快流完时，用Ep管接流出的样品，标记好“lastflowthrough”，用于后续检测。关键步骤：口样品体积小时可以减速，使样品充分与Ni2+进行反应，能挂柱的都挂上口第一次纯化某蛋白时，建议收集流出液，避免蛋白不挂柱损失蛋白（注意避免气泡进入柱子）洗脱目的蛋白预计消耗时间：40min1.提前将AKTA的A，B泵用水进行systemwash。再用buffer，即A泵用Ni-Bindingbuffer，B泵用Elutionbuffer进行systemwash。2.将系统流速设置1mL/min，manualrun时把Ni柱湿接到AKTA纯化仪上。3.调程序（以AKTAPrime为例）：设置3mL/min，0.4MPa，Load。check point (mL)%BFraction(mL)004%5304%80560%59060%4.程序跑完后，将结果保存至自已的文件夹中，写明日期、样品名、程序类型（Ni柱洗脱还是分子筛等）。5.在图谱中与目的蛋白的峰对应的样品收集到一个干净的50mL离心管，取40μL至Ep管中，标记好“Nielution”，与前面的样品以及跑蛋白电泳，检测纯化效果。6.AKTA的A，B泵用水进行systemwash

buffer使用前在放在4 °C冰箱预冷，准备收集管，保证有足够的干净且已烘干的玻璃管 r 器械（EQUIPMENT） Thermo落地式离心机（使用前预冷至4 °C），AKTA FPLC纯化仪，超声仪，抽滤泵 实验步骤（PROCEDURE） 以MBP融合表达蛋白为例： A. 纯化蛋白——一次Ni亲和柱 （详见3.2.6金属螯合层析章节） ► 破菌 ►预计消耗时间：30 min~1 h 1. 将冻存在-80 °C冰箱的菌拿出来，放在水里解冻，根据细菌湿重每克5~10 mL加入Ni-Binding buffer。 解冻后把金属烧杯放在冰上，进行超声。对于不稳定的蛋白，可加入PMSF以防止蛋白降解。 2. 将烧杯至于冰水中进行超声破碎。液流不呈丝状时，说明已超声完全。 3. 用完后用水洗探头。 ▲ 关键步骤： ♫ 观察蛋白质纯化过程中蛋白质的降解和沉淀情况，当蛋白易降解时，可在所有缓冲液及蛋白收集。液 中加入通用丝氨酸蛋白酶抑制剂（PMSF，终浓度0.5 mM）抑制蛋白降解。 ► 离心、过滤 ►预计消耗时间：40 min 1. 将超声好的菌液平均倒入离心管中，配平好，放入已预冷至4 °C的落地式离心机。 2. 14000 rpm 离心20分钟，将上清倒入小烧杯中。 3. 组装好抽滤装置进行抽滤（注意不要漏，样品和滤瓶均要放在冰上）。 ► 平衡Ni-NTA柱 ►预计消耗时间：20 min 1. 将Ni柱从4 °C冰箱取出，这时柱里面是20%酒精。 2. 限压0.4 Mpa，流速3 mL/min，水洗Ni柱10分钟。 3. 换成Ni-Binding buffer再洗10分钟，将Ni柱平衡好。 ► 上样使蛋白挂柱 ►预计消耗时间：根据样品体积而定 1. 将Super loop和Ni柱都放在冰上，用洗好的绿色的连接管湿接Ni柱。 2. 蠕动泵流速设定为3 mL/min，限压为0.4 MPa。 3. 当样品流完一个柱体积时，用Ep管接流出的样品，标记好“first flow through”。 4. 当样品快流完时，用Ep管接流出的样品，标记好“last flow through”，用于后续检测。 ▲关键步骤： ♫ 样品体积小时可以减速，使样品充分与Ni2+进行反应，能挂柱的都挂上 ♫ 第一次纯化某蛋白时，建议收集流出液，避免蛋白不挂柱损失蛋白（注意避免气泡进入柱子） ► 洗脱目的蛋白 ►预计消耗时间：40 min 1. 提前将AKTA的A，B泵用水进行system wash。再用buffer，即A泵用Ni-Binding buffer，B泵用Elution buffer进行system wash。 2. 将系统流速设置1 mL/min，manual run时把Ni柱湿接到AKTA纯化仪上。 3. 调程序（以AKTA Prime为例）：设置3 mL/min，0.4 MPa，Load。 check point（mL） %B Fraction（mL） 0 4% 0 30 4% 5 80 60% 5 90 60% 5 4. 程序跑完后，将结果保存至自己的文件夹中，写明日期、样品名、程序类型（Ni柱洗脱还是分子筛 等）。 5. 在图谱中与目的蛋白的峰对应的样品收集到一个干净的50 mL离心管，取40 μL至Ep管中，标记好“Ni elution”，与前面的样品以及跑蛋白电泳，检测纯化效果。 6. AKTA的A，B泵用水进行system wash

7.将用完的收集管用自来水冲5遍，用蒸馏水冲3遍后，晾在试管架上。8.用完的Ni柱要进行清洗和重灌镍，详见附录的“柱子型号、特点及清洁方法”关键步骤：口注意Ni柱上游的连接管中不要残留不明液体，以免影响纯化效果。口在多次使用后Ni柱变为白色或灰色时，则需要重新灌填料，以免造成柱子与Ni亲和力差从而影响蛋白纯化。柱子使用完毕后清洗并用灌以20%乙醇储存。TEV酶切预计消耗时间：12~16h（详见3.2.5TEV蛋白酶的使用）1.根据峰图和SDS-PAGE收集目的蛋白，测OD280值。2.根据OD280计算并加入相应体积的TEV蛋白酶，同时加入2mMDTT、1mMEDTA（终浓度），过夜酶切。关键步骤：口建议使用TEV和目的蛋白摩尔比例为1：10放置在四度冰箱过夜酶切。只高盐能够抑制TEV蛋白酶的活性，因此TEV酶切时尽量控制盐浓度小干0.5MDTEV消化后，由于DTT和EDTA的原因，需要透析或凝胶过滤才能进行二次Ni纯化。口在使用TEV酶切蛋白时，需要蛋白透析buffer中存在DTT，因此最好不要一边透析一边酶切，酶切和透析分开来做，这样有助于实现良好的酶切效果。B.纯化蛋白一大分子筛（详见3.2.7分子筛章节）/样品准备预计消耗时间：20min1.实验室有120mL、320mL等规格的大分子筛（详见3.2.2蛋白纯化柱子的介绍及清洁方法），根据洗脱蛋白体积及蛋白性质选择分子筛类型（蛋白洗脱体积要小于分子筛柱体积的1/10）。2.倒入高速离心管中，放入已预冷至4C的落地式离心机中，14000rpm离心15分钟。3.小心倒入干净的50mL离心管中，放置在冰上。4.用注射器将样品打入Superloop，避免气泡。5.Superloop连接至AKTA，可以manualrun0.5mL/min，接好后stop。关键步骤：口分子筛非常忌讳进气泡，连接时、样品打入Superloop时避免气泡口过分子筛前样品要离心或者过滤，避免沉淀进入分子筛造成堵塞过分子筛预计消耗时间：4～5小时1.不同的分子量的样品出峰的时间不同，下面以30mL体积样品，分子量为55kDa，用AKTAPrime纯化仪来过400mL柱子为例，设定程序：流check速限压连接状Fraction%Bpoint (mL)(mL/min)(MPa)态(mL)01.50.300inject30001.50.3load502501.50.3load01.50.30400load004501.50.3load注：程序可以根据实际情况修改2.把收集的流出管放在第一个收集管上，分子筛一般会有很多个收集管，如果不从第一管开始的话也可以通过简单计算来确定对应峰的管号。关键步骤：若是第一次过分子筛，可早些收样，以免错过样品峰收集样品、检测纯度预计消耗时间：1.5小时

7. 将用完的收集管用自来水冲5遍，用蒸馏水冲3遍后，晾在试管架上。 8. 用完的Ni柱要进行清洗和重灌镍，详见附录的“柱子型号、特点及清洁方法”。 ▲关键步骤： ♫ 注意Ni柱上游的连接管中不要残留不明液体，以免影响纯化效果。 ♫ 在多次使用后Ni柱变为白色或灰色时，则需要重新灌填料，以免造成柱子与Ni亲和力差从而影响蛋白纯 化。 ♫ 柱子使用完毕后清洗并用灌以20%乙醇储存。 ► TEV酶切 ►预计消耗时间：12~16 h （详见3.2.5 TEV蛋白酶的使用） 1. 根据峰图和SDS-PAGE收集目的蛋白，测OD280值。 2. 根据OD280计算并加入相应体积的TEV蛋白酶，同时加入2 mM DTT、1 mM EDTA（终浓度），过夜酶 切。 ▲关键步骤： ♫ 建议使用TEV和目的蛋白摩尔比例为1：10放置在四度冰箱过夜酶切。 ♫ 高盐能够抑制TEV 蛋白酶的活性，因此TEV酶切时尽量控制盐浓度小于0.5M。 ♫ TEV消化后，由于DTT和EDTA的原因，需要透析或凝胶过滤才能进行二次Ni纯化。 ♫ 在使用TEV酶切蛋白时，需要蛋白透析buffer中存在DTT，因此最好不要一边透析一边酶切，酶切和透 析分开来做，这样有助于实现良好的酶切效果。 B. 纯化蛋白——大分子筛 （详见3.2.7 分子筛章节） ► 样品准备 ►预计消耗时间：20 min 1. 实验室有120 mL、320 mL等规格的大分子筛（详见3.2.2 蛋白纯化柱子的介绍及清洁方法），根据洗 脱蛋白体积及蛋白性质选择分子筛类型（蛋白洗脱体积要小于分子筛柱体积的1/10）。 2. 倒入高速离心管中，放入已预冷至4 °C的落地式离心机中，14000 rpm离心15分钟。 3. 小心倒入干净的50 mL离心管中，放置在冰上。 4. 用注射器将样品打入Super loop，避免气泡。 5. Super loop连接至AKTA，可以manual run 0.5 mL/min，接好后stop。 ▲关键步骤： ♫ 分子筛非常忌讳进气泡，连接时、样品打入Super loop时避免气泡 ♫ 过分子筛前样品要离心或者过滤，避免沉淀进入分子筛造成堵塞 ► 过分子筛 ►预计消耗时间：4 ~ 5小时 1. 不同的分子量的样品出峰的时间不同，下面以30 mL体积样品，分子量为55 kDa，用AKTA Prime纯化 仪来过400 mL柱子为例，设定程序： check point （mL） 流 速 （mL/min） 限 压 （MPa） 连 接 状 态 Fraction （mL） %B 0 1.5 0.3 inject 0 0 30 1.5 0.3 load 0 0 250 1.5 0.3 load 5 0 400 1.5 0.3 load 0 0 450 1.5 0.3 load 0 0 ▲ 注：程序可以根据实际情况修改 2. 把收集的流出管放在第一个收集管上，分子筛一般会有很多个收集管，如果不从第一管开始的话也可 以通过简单计算来确定对应峰的管号。 ▲关键步骤： 若是第一次过分子筛，可早些收样，以免错过样品峰 ► 收集样品、检测纯度 ►预计消耗时间：1.5小时

1.将目的蛋白峰所对应的收集管中蛋白倒入于净的50mL离心管中，放在冰上，并加入5mMDTT，2mMEDTA，0.5mMPMSF（终浓度）。如果要续过二次镍柱，则不需加DTT、EDTA。2.取4OμL至Ep管中，标记“gelfiltration”来用SDS-PAGE检测样品纯度。分子筛清洗预计消耗时间：8小时1.每次用完要用水洗一个柱体积，用20%酒精罐一个柱体积。每用完5次，水洗一个柱体积后，用0.2MNaOH清洗一个柱体积，再用水清洗3个柱体积，最后用20%酒精罐一个柱体积。详见附录中的“柱子型号、特点及清洁方法”。2.清洗完分子筛之后，在标签纸上写明日期、使用者、目前柱子里罐的是什么溶液，方便管理，并且也方便后面的人使用。关键步骤：口氢氧化钠要放在塑料瓶中，因为玻璃瓶中的硅酸盐会被碱性的氢氧化钠所腐蚀，成为硅酸钠，因此碱性物质一定不能放在玻璃瓶中。品清洗及使用分子筛时注意设置限压，不能超过最大压力，否则会破坏分子筛。C.纯化蛋白—二次Ni亲和柱平衡Ni-NTA柱（同上）预计消耗时间：20min湿接Ni柱预计消耗时间：10min1.提前将AKTA的A，B泵用水进行systemwash。再用buffer，即A泵用Ni-Bindingbuffer（也可用GFbuffer），B泵用Elutionbuffer进行systemwash。2.将系统流速设置1mL/min，manualrun时把Ni柱湿接到AKTA纯化仪上。3.调程序（以AKTAPrime为例）：设置3mL/min，0.4MPa，Load，4.使用A冲洗已接好的Ni柱至UV线齐平。样品准备预计消耗时间：20min1根据峰图和SDS-PAGE收集目的蛋白，倒入高速离心管中，放入已预冷至4C的落地式离心机中，14000rpm离心15分钟。2.小心倒入干净的50mL离心管中，放置在冰上。3.用注射器将样品打入Superloop，避免气泡（上样体积一定要小于柱体积的10%）。4.Superloop连接至AKTA，可以manualrun3mL/min，接好后stop。关键步骤：口在纯化的每一步都要进行SDS-PAGE，以鉴定目的蛋白的存在及其纯度。连接时、样品打入Superloop时避免气泡。开始程序预计消耗时间：40mincheck point (mL)%BFraction（mL)5LoopVolume.2050%80540%90560%关键步骤：大多数蛋白在TEV切掉MBP后不会挂Ni先被洗脱下来，而MBP因含有Histag则会在拉B梯度时才会被洗脱下来，从而达到目的蛋白与MBP分离的目的。不同蛋白性质不同，为保险起见，应从开始程序到结束程序都要进行收集。有部分蛋白由于其表面有组氨酸和谷氨酸残基簇，可能对Ni柱具有较高亲和力，在洗脱阶段才能被洗脱。这种情况，建议采用gelfiltrationbuffer作为其bindingbuffer。在洗脱时建议采用比第一次镍柱更缓和的梯度，便于提高洗脱分辨率。D.纯化蛋白——24mL分子筛平衡分子筛预计消耗时间：2~3小时1.使用分子筛之前一定要先平衡好，可在泵上或AKTA上进行；注意设定限压和流速，以免破坏分子筛。2.先用水冲洗一个柱体积，再用GFbuffer平衡分子筛

1. 将目的蛋白峰所对应的收集管中蛋白倒入干净的50 mL离心管中，放在冰上，并加入5 mM DTT，2 mM EDTA，0.5 mM PMSF（终浓度）。如果要续过二次镍柱，则不需加DTT、EDTA。 2. 取40 μL至Ep管中，标记“gel filtration”来用SDS-PAGE检测样品纯度。 ► 分子筛清洗 ►预计消耗时间：8小时 1. 每次用完要用水洗一个柱体积，用20%酒精罐一个柱体积。每用完5次，水洗一个柱体积后，用0.2 M NaOH清洗一个柱体积，再用水清洗3个柱体积，最后用20%酒精罐一个柱体积。详见附录中的“柱子型 号、特点及清洁方法”。 2. 清洗完分子筛之后，在标签纸上写明日期、使用者、目前柱子里罐的是什么溶液，方便管理，并且也方 便后面的人使用。 ▲关键步骤： ♫氢氧化钠要放在塑料瓶中，因为玻璃瓶中的硅酸盐会被碱性的氢氧化钠所腐蚀，成为硅酸钠，因此碱性 物质一定不能放在玻璃瓶中。 ♫ 清洗及使用分子筛时注意设置限压，不能超过最大压力，否则会破坏分子筛。 C. 纯化蛋白——二次Ni亲和柱 ► 平衡Ni-NTA柱（同上） ►预计消耗时间：20 min ► 湿接Ni柱 ►预计消耗时间：10 min 1.提前将AKTA的A，B泵用水进行system wash。再用buffer，即A泵用Ni-Binding buffer（也可用GF buffer），B泵用Elution buffer进行system wash。 2. 将系统流速设置1 mL/min，manual run时把Ni柱湿接到AKTA纯化仪上。 3. 调程序（以AKTA Prime为例）：设置3 mL/min，0.4 MPa，Load。 4. 使用A冲洗已接好的Ni柱至UV线齐平。 ► 样品准备 ►预计消耗时间：20 min 1. 根据峰图和SDS-PAGE收集目的蛋白，倒入高速离心管中，放入已预冷至4 °C的落地式离心机中， 14000 rpm离心15分钟。 2. 小心倒入干净的50 mL离心管中，放置在冰上。 3. 用注射器将样品打入Super loop，避免气泡（上样体积一定要小于柱体积的10%）。 4. Super loop连接至AKTA，可以manual run 3 mL/min，接好后stop。 ▲ 关键步骤： ♫ 在纯化的每一步都要进行SDS-PAGE，以鉴定目的蛋白的存在及其纯度。 ♫ 连接时、样品打入Super loop时避免气泡。 ► 开始程序 ►预计消耗时间：40 min check point（mL） %B Fraction（mL） Loop Volume - 5 20 0% 5 80 40% 5 90 60% 5 ▲关键步骤： 大多数蛋白在TEV切掉MBP后不会挂Ni先被洗脱下来，而MBP因含有His tag则会在拉B梯度时才会被洗脱下 来，从而达到目的蛋白与MBP分离的目的。不同蛋白性质不同，为保险起见，应从开始程序到结束程序都 要进行收集。 有部分蛋白由于其表面有组氨酸和谷氨酸残基簇，可能对Ni柱具有较高亲和力，在洗脱阶段才能被洗脱。 这种情况，建议采用gel filtration buffer作为其binding buffer。 在洗脱时建议采用比第一次镍柱更缓和的梯度，便于提高洗脱分辨率。 D. 纯化蛋白—— 24 mL分子筛 ► 平衡分子筛 ►预计消耗时间：2~3小时 1. 使用分子筛之前一定要先平衡好，可在泵上或AKTA上进行；注意设定限压和流速，以免破坏分子筛。 2. 先用水冲洗一个柱体积，再用GF buffer平衡分子筛

3.将平衡好的分子筛湿接到AKTA上，用GFbuffer冲洗分子筛至UV线齐平。7开始程序预计消耗时间：30~40min1.将样品4°C离心机高速离心15min。2.根据样品体积选择合适的loop（0.5/1/2mL），一般需要选取至少两倍样品体积的loop（比如0.5mL样品用1mLloop，1mL样品用2mLloop）。3.先用水冲洗三次自动上样环，然后再用GFbuffer冲洗3次。4.用注射器将蛋白样品打入自动上样环中（注意不要进气泡）。5.这里以1mLloop为例，设定程序：check point (mL)Fraction(mL/tube)01（loopvolume)50260.5关键步骤：一般24mL分子筛用于分析蛋白聚合情况，且蛋白质非常容易使分子筛堵塞，尤其是24mL高分辨率分子筛，上样量要小于10mg，体积小于1.0mL。上样前样品需要4C高速离心。Marker实例：Bio-Rad蛋白质量标准24mL分子筛图谱。801.35KD60670KDJ58KD17KD(u)40OB20024681012141618202224262830Butianvolume(m)蛋白保存预计消耗时间：15min1.根据2ndNi后SDS-PAGE图，来判断接下来是否还需要进一步纯化。如果目的蛋白存在较多杂蛋白，可进一步查阅相关文献了解蛋白性质，然后进一步纯化（疏水柱、离子交换柱等，详见3.2蛋白纯化技术章节）：如果目的蛋白条带单一纯度较高，则可测量蛋白浓度并进一步浓缩后于-80°C冰箱内存放。2.蛋白浓度计算公式OD×10×稀释倍数mg/mL蛋白浓度=0.1% Abs蛋白浓度（mg/mL）物质的摩尔浓度=M蛋白分子量MW（g/moL）关键步骤：蛋白样品采用小体积冷冻（20~200μL），“速冻速溶”一一直接放入-80C冰箱中存放，解冻蛋白时将Ep管握在手中快速解冻，以减少对蛋白的伤害。日OD280测量值一般在0.2~0.8较为准确，若蛋白浓度过高，可稀释后再进行测量。口测量蛋白质浓度后在保存管上标记清楚

3. 将平衡好的分子筛湿接到AKTA上，用GF buffer冲洗分子筛至UV线齐平。 ► 开始程序 ►预计消耗时间：30~40 min 1. 将样品4 °C离心机高速离心15 min。 2. 根据样品体积选择合适的loop（0.5/1/2 mL），一般需要选取至少两倍样品体积的loop（比如0.5 mL样 品用1 mL loop，1 mL 样品用2 mL loop）。 3. 先用水冲洗三次自动上样环，然后再用GF buffer冲洗3次。 4. 用注射器将蛋白样品打入自动上样环中（注意不要进气泡）。 5. 这里以1 mL loop为例，设定程序： check point（mL） Fraction（mL/tube） 1（loop volume） 0 5 0 26 0.5 ▲ 关键步骤： 一般24 mL分子筛用于分析蛋白聚合情况，且蛋白质非常容易使分子筛堵塞，尤其是24 mL高分辨率分子 筛，上样量要小于10 mg，体积小于1.0 mL。 上样前样品需要4 °C高速离心。 Marker实例： Bio-Rad蛋白质量标准24 mL分子筛图谱。 ► 蛋白保存 ►预计消耗时间：15 min 1. 根据2nd Ni后SDS-PAGE图，来判断接下来是否还需要进一步纯化。如果目的蛋白存在较多杂蛋白，可 进一步查阅相关文献了解蛋白性质，然后进一步纯化（疏水柱、离子交换柱等，详见3.2蛋白纯化技术 章节）；如果目的蛋白条带单一纯度较高，则可测量蛋白浓度并进一步浓缩后于-80 °C冰箱内存放。 2. 蛋白浓度计算公式 ▲ 关键步骤： ♫ 蛋白样品采用小体积冷冻（20~200 μL），“速冻速溶”——直接放入- 80 °C冰箱中存放，解冻蛋白时 将Ep管握在手中快速解冻，以减少对蛋白的伤害。 ♫ OD280测量值一般在0.2~0.8较为准确，若蛋白浓度过高，可稀释后再进行测量。 ♫ 测量蛋白质浓度后在保存管上标记清楚

将蛋白质浓缩到尽可能高的浓度以便结晶。尽量避免经常冻融蛋白质样本。针对性建议（TROUBLESHOOTING）1.蛋白质要尽可能保存在冰上，或者4C冰箱中。2.提前计划好实验流程，预约摇床、AKTA、平衡分子筛等。3.浓缩蛋白质时选择合适的浓缩管，应选择截留小于蛋白质分子量一半的浓缩管。4.，选用合适的分子筛色谱柱。GE公司的24mL10/300GL柱型是分析型分子筛，适合对少量蛋白进行分离和鉴定聚合程度。载量建议在5mg以内，体积在1mL以内。Superdex-75适用于515kDa蛋白的分离，而Superdex-200适用于15~100kDa蛋白的分离，Superdex-300或者Superose-6适用于大于100kDa的蛋白分离。5.为防止蛋白降解，大多数蛋白样品中要添加EDTA和DTT，但是当需要过Ni柱的样品中不能有EDTA和DTT，EDTA是金属螯合剂，它可以把Ni离子从柱子上洗下来，DTT是还原剂，它可以把Ni离子还原成棕色的物质，影响纯化效果。6.不同的蛋白质性质不同，在纯化前尽可能多地了解蛋白质性质，包括PI、缓冲体系、潜在的配体，及相互作用蛋白等；一般纯化蛋白用到的buffer的pH值要远离蛋白等电点。7．不同的溶解度在pH值、离子强度、温度等方面有很大的不同，当蛋白质在标准条件（如0.25MNaCl，20mMTris-HCIpH8.0）纯化过程中形成沉淀时，可尝试提高盐浓度、调整pH值、或添加一些稳定剂（2-10%甘油，20-100mM精氨酸）等方法，试着找到一个易于纯化、结晶的条件。8.对于蛋白质交联等无胺缓冲系统，可采用磷酸盐、HEPES等缓冲液。9.如果蛋白样品用于圆二色谱实验，需要把缓冲液换成磷酸盐以及低盐体系，降低背景。10.如果蛋白样品用于结晶，尽量选用低盐、低缓冲液的buffer，比如纯水，100mMNaCl，10mMTris-HCIpH8.0。3.1.2哺乳动物表达系统简介（INTRODUCTION）哺乳动物表达系统相比原核表达等其他系统的优势在于能够使来源于哺乳动物的蛋白质正确的折叠，从而最大程度的接近天然构象，因为该系统能够提供复杂的糖基化等多种翻译后修饰和加工，因而表达产物在分子结构、理化性质和生物学功能方面做接近天然的蛋白质。本实验室目前只是采用最常用的哺乳动物细胞HEK293T和pTT5载体对融合人IgG1Fctag的蛋白质进行瞬时表达，并利用ProteinA纯化柱对分泌到培养基上清中的蛋白进行纯化，Fctag可以在纯化后采用TEV酶切除。材料（MATERIALS）试剂（REAGENTS）转染试剂PEl：称取0.05gPEI粉末倒入45mL超纯水中，利用磁力搅拌。加入12M盐酸调节pH至小于2，室温搅拌3h以上至PEI彻底溶解。加入10MNaOH溶液调节pH至6.9~7.1，加水定容至50mL。采用0.22μm针头滤器过滤除菌。分装500μL/管，-20C可以储存1年，解冻后放在4C可保存2星期，不能解冻后再复冻。细胞培养试剂：高糖DMEM、FBS、P/S双抗。Runningbuffer:0.15MNaCl,20mMNa2HPO4pH7.0。0.1M乙酸：取2.874mL冰醋酸加入500mLddH20并混均。1M Tris-HCIpH8.0。ProteinA纯化柱。口实验前准备（SETUP）配置好以上所有试剂，观察CO2是否充足。复苏HEK293T细胞并培养至第二代。抽提无内毒素表达载体质粒。器械（EQUIPMENT）超净工作台、离心机、螨动泵、AKTA纯化仪

♫ 将蛋白质浓缩到尽可能高的浓度以便结晶。 ♫ 尽量避免经常冻融蛋白质样本。 针对性建议（TROUBLESHOOTING） 1. 蛋白质要尽可能保存在冰上，或者4 °C冰箱中。 2. 提前计划好实验流程，预约摇床、AKTA、平衡分子筛等。 3. 浓缩蛋白质时选择合适的浓缩管，应选择截留小于蛋白质分子量一半的浓缩管。 4. 选用合适的分子筛色谱柱。GE公司的24 mL 10/300 GL 柱型是分析型分子筛，适合对少量蛋白进行分 离和鉴定聚合程度。载量建议在5 mg 以内，体积在1 mL以内。Superdex-75适用于5~15 kDa蛋白的分 离，而Superdex-200适用于15~100 kDa蛋白的分离，Superdex-300或者Superose-6适用于大于100 kDa的 蛋白分离。 5. 为防止蛋白降解，大多数蛋白样品中要添加EDTA和DTT，但是当需要过Ni柱的样品中不能有EDTA和 DTT，EDTA是金属螯合剂，它可以把Ni离子从柱子上洗下来，DTT是还原剂，它可以把Ni离子还原 成棕色的物质，影响纯化效果。 6. 不同的蛋白质性质不同，在纯化前尽可能多地了解蛋白质性质，包括PI、缓冲体系、潜在的配体，及 相互作用蛋白等；一般纯化蛋白用到的buffer的pH值要远离蛋白等电点。 7. 不同的溶解度在pH值、离子强度、温度等方面有很大的不同，当蛋白质在标准条件（如0.25 M NaCl，20 mM Tris-HCl pH 8.0）纯化过程中形成沉淀时，可尝试提高盐浓度、调整pH值、或添加一些 稳定剂（2-10%甘油，20-100 mM精氨酸）等方法，试着找到一个易于纯化、结晶的条件。 8. 对于蛋白质交联等无胺缓冲系统，可采用磷酸盐、HEPES等缓冲液。 9. 如果蛋白样品用于圆二色谱实验，需要把缓冲液换成磷酸盐以及低盐体系，降低背景。 10. 如果蛋白样品用于结晶，尽量选用低盐、低缓冲液的buffer，比如纯水，100 mM NaCl，10 mM Tris￾HCl pH 8.0。 3.1.2 哺乳动物表达系统 简介（INTRODUCTION） 哺乳动物表达系统相比原核表达等其他系统的优势在于能够使来源于哺乳动物的蛋白质正确的折叠， 从而最大程度的接近天然构象，因为该系统能够提供复杂的糖基化等多种翻译后修饰和加工，因而表达产 物在分子结构、理化性质和生物学功能方面做接近天然的蛋白质。本实验室目前只是采用最常用的哺乳动 物细胞HEK293T和pTT5载体对融合人IgG1 Fc tag的蛋白质进行瞬时表达，并利用Protein A纯化柱对分泌到 培养基上清中的蛋白进行纯化，Fc tag可以在纯化后采用TEV酶切除。 材料（MATERIALS） r 试剂（REAGENTS） 转染试剂PEI：称取0.05 g PEI粉末倒入45 mL超纯水中，利用磁力搅拌。加入12 M盐酸调节pH至小于2， 室温搅拌3 h以上至PEI彻底溶解。加入10 M NaOH溶液调节pH至6.9~7.1，加水定容至50 mL。采用0.22 μm针头滤器过滤除菌。分装500 μL/管，-20 °C可以储存1年，解冻后放在4 °C可保存2星期，不能解冻后 再复冻。 细胞培养试剂：高糖DMEM、FBS、P/S双抗。 Running buffer：0.15 M NaCl，20 mM Na2HPO4 pH 7.0。 0.1 M乙酸：取2.874 mL冰醋酸加入500 mL ddH2O并混均。 1 M Tris-HCl pH 8.0。 Protein A纯化柱。 r 实验前准备（SETUP） 配置好以上所有试剂，观察CO2是否充足。复苏HEK293T细胞并培养至第二代。抽提无内毒素表达载体 质粒。 r 器械（EQUIPMENT） 超净工作台、离心机、蠕动泵、AKTA纯化仪

实验步骤（PROCEDURE）1.培养细胞1）提前18~24h接种适量的HEK293T细胞（约1.5×106/皿）至100mm培养血，每个血加入10mLDMEM+10%FBS培养。2）当细胞融合达到90%左右时，即可进行转染实验。2.转染和表达1）预热高糖DMEM。2）取1根1.5mL离心管，加入0.5mL高糖DMEM，再加入8μg转染的质粒（无内毒素），吹打混匀，命名为溶液1。3）取1根1.5mL离心管，加入0.5mL高糖DMEM，再加入32uLPEI试剂（1mg/mL），吹打混匀，命名为溶液2。4）将溶液1加入溶液2，吹打混匀，命名为溶液3。5)室温孵育15min。6)滴加1mL以上溶液3至1血（悬空逐滴滴到血的各处），将培养血前后左右各shake10次以混匀。放置培养血至细胞培养箱培养48~72h，从培养24h后开始，每隔12h收集上清并换液一次。上清7)中加入终浓度为2mMEDTA混匀后于4°C储存。3.纯化1）将收集的培养基上清5000g、4C离心10min，采用0.45um滤膜过滤。2）1:2将培养基上清稀释至Runningbuffer中。测量pH值应为6.0~7.0之间，冰面放置。3）使用5个柱体积的Runningbuffer平衡ProteinA柱子。4)将培养基上清稀释液过柱上样，流速设置为4mL/min。5）连接AKTA纯化仪，使用10个C.V.的Runningbuffer以流速为3mL/min洗柱，直到OD280达到基线。6)使用0.1M乙酸（pH3.0~4.5）以3mL/min流速进行梯度洗脱，梯度从0~100%，洗脱体积为30mL。每管收集1mL，每个收集管中加入0.2mL1MTris（pH8.0）以中和其酸性。继续采用4个柱体积的100%0.1M乙酸洗柱。7）8）用10个柱体积的水洗柱，然后过2个柱体积的20%乙醇，柱子存放于4℃。A关键步骤：转染质粒前，细胞的生长状态一定要好。附：实例结果hTIGIT-TEV-FC150-100me四-5050-oX10203040500ElutionVolume (ml)从3块150mm培养血的HEK293T细胞上清中纯化hTIG/T-TEV-Fc的层析图针对性建议（TROUBLESHOOTING）1.以上步骤中的细胞量及转染试剂量可以按比例缩小或放大。通常一次表达至少需要3个100mm培养Il。2.通常GE公司的1mLProteinAbeads可以结合约20mglgG1蛋白。3.哺乳动物细胞表达蛋白的量通常较低，不同的蛋白表达量又会不尽相同，如果蛋白表达量高，3个100mm培养皿的细胞培养上清中可以纯化得到约0.5mg蛋白。3.1.3昆虫表达系统简介（INTRODUCTION）

实验步骤（PROCEDURE） 1. 培养细胞 1) 提前18~24 h接种适量的HEK293T细胞（约1.5×106/皿）至100 mm培养皿，每个皿加入10 mL DMEM+10% FBS培养。 2) 当细胞融合达到90%左右时，即可进行转染实验。 2. 转染和表达 1) 预热高糖DMEM。 2) 取1根1.5 mL离心管，加入0.5 mL高糖DMEM，再加入8 μg转染的质粒（无内毒素），吹打混匀， 命名为溶液1。 3) 取1根1.5 mL离心管，加入0.5 mL高糖DMEM，再加入32 μL PEI试剂（1 mg/mL），吹打混匀，命 名为溶液2。 4) 将溶液1加入溶液2，吹打混匀，命名为溶液3。 5) 室温孵育15 min。 6) 滴加1 mL以上溶液3至1皿（悬空逐滴滴到皿的各处），将培养皿前后左右各shake 10次以混匀。 7) 放置培养皿至细胞培养箱培养48~72 h，从培养24 h后开始，每隔12 h收集上清并换液一次。上清 中加入终浓度为2 mM EDTA混匀后于4°C储存。 3. 纯化 1) 将收集的培养基上清5000 g、4 °C离心10 min，采用0.45 μm滤膜过滤。 2) 1:2将培养基上清稀释至Running buffer中。测量pH值应为6.0~7.0之间，冰面放置。 3) 使用5 个柱体积的Running buffer平衡Protein A柱子。 4) 将培养基上清稀释液过柱上样，流速设置为4 mL/min。 5) 连接AKTA纯化仪，使用10个C.V.的Running buffer以流速为3 mL/min洗柱，直到OD280达到基线。 6) 使用0.1 M乙酸（pH 3.0~4.5）以3 mL/min流速进行梯度洗脱，梯度从0~100%，洗脱体积为30 mL。每管收集1 mL，每个收集管中加入0.2 mL 1 M Tris（pH 8.0）以中和其酸性。 7) 继续采用4个柱体积的100% 0.1M乙酸洗柱。 8) 用10个柱体积的水洗柱，然后过2个柱体积的20%乙醇，柱子存放于4 °C。 ▲ 关键步骤：转染质粒前，细胞的生长状态一定要好。 附：实例结果 从3块150 mm培养皿的HEK293T细胞上清中纯化hTIGIT-TEV-Fc的层析图 针对性建议（TROUBLESHOOTING） 1. 以上步骤中的细胞量及转染试剂量可以按比例缩小或放大。通常一次表达至少需要3个100 mm培养 皿。 2. 通常GE公司的1 mL Protein A beads可以结合约20 mg IgG1蛋白。 3. 哺乳动物细胞表达蛋白的量通常较低，不同的蛋白表达量又会不尽相同，如果蛋白表达量高，3个100 mm培养皿的细胞培养上清中可以纯化得到约0.5 mg蛋白。 3.1.3 昆虫表达系统 简介（INTRODUCTION）