《临床生物化学》课程教学资源（实验指导）第3章 电泳技术

第三章电泳技术在直流电场中，带电粒子向带相反电荷电极移动的现象称为电泳(electrophoresis）。电泳现象在18世纪被发现，1937年瑞典人Tiseliusy研制了第台自由界面电泳仪，但未能推广，直到1948年Wieland建立了区带电泳后，电泳技术才得以迅速发展。电泳技术可分为自由电泳(无支持物)和区带电泳(有支持物)两大类，其中自由电泳因结构复杂、操作要求高等原因应用并不广泛。而区带电泳可用名种类型的物质做支持体应用较广泛，其中包括滤纸电泳、薄层电泳（薄膜及薄板）、凝胶电泳(琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺)和毛细管高压电泳等。电泳技术除了用于小分子物质的分离分析外，最主要用于蛋白质、核酸、酶、甚至病毒与细胞的研究。由于某些电泳法设备简单、操作方便和具有较高的分辨率，已成为医学检验中常用的技术。实验9醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋质【原理】血清中各种蛋白质的等电点(pl)大都低于7.0，在pH8.6的缓冲液中，它们都电离成负离子，在电场中向正极移动。因各种蛋白质pI不同，在同一pH下带电荷量有差异，同时各蛋白质的分子大小与分子形状也不相同，因此在同一电场中泳动速度也不同。带电荷多，分子量小者，泳动较快：反之则较慢。醋酸纤维素薄膜(CAM)电泳可将血清蛋白分离为5条区带，从正极端起依次为白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白及-球蛋白。由于染色时染料与蛋白质的结合与蛋白质的量成正比，因此将各蛋白区带剪下，经脱色、比色或经透明处理后直接用光密度计扫描，即可计算出血清各蛋白组分的相对百分数。如同时测定出血清总蛋白浓度，还可计算出各蛋白组分的绝对浓度。【试剂与器材】1.巴比妥缓冲液(pH8.6，离子强度0.06）称取巴比妥钠12.36g、巴比妥2.21g，于500ml蒸馏水中加热溶解，冷却至室温后，用蒸馏水定容至1L

1 第三章 电泳技术 在 直 流 电 场 中 ， 带 电 粒 子 向 带 相 反 电 荷 电 极 移 动 的 现 象 称 为 电 泳 (electrophoresis)。电泳现象在 18 世纪被发现，1937 年瑞典人 Tiseliusy 研制了第一 台自由界面电泳仪，但未能推广，直到 1948 年 Wieland 建立了区带电泳后，电泳技 术才得以迅速发展。电泳技术可分为自由电泳(无支持物)和区带电泳(有支持物)两大 类，其中自由电泳因结构复杂、操作要求高等原因应用并不广泛。而区带电泳可用各 种类型的物质做支持体应用较广泛，其中包括滤纸电泳、薄层电泳(薄膜及薄板)、凝 胶电泳(琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺)和毛细管高压电泳等。电泳技术除了用 于小分子物质的分离分析外，最主要用于蛋白质、核酸、酶、甚至病毒与细胞的研 究。由于某些电泳法设备简单、操作方便和具有较高的分辨率，已成为医学检验中常 用的技术。 实验 9 醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋质 【原理】 血清中各种蛋白质的等电点(pI)大都低于 7.0，在 pH 8.6 的缓冲液 中，它们都电离成负离子，在电场中向正极移动。因各种蛋白质 pI 不同，在同一 pH 下带电荷量有差异，同时各蛋白质的分子大小与分子形状也不相同，因此在同一电场 中泳动速度也不同。带电荷多，分子量小者，泳动较快；反之则较慢。 醋酸纤维素薄膜(CAM)电泳可将血清蛋白分离为 5 条区带，从正极端起依次为白 蛋白、1 -球蛋白、2 -球蛋白、β-球蛋白及γ-球蛋白。由于染色时染料与蛋白质的 结合与蛋白质的量成正比，因此将各蛋白区带剪下，经脱色、比色或经透明处理后直 接用光密度计扫描，即可计算出血清各蛋白组分的相对百分数。如同时测定出血清总 蛋白浓度，还可计算出各蛋白组分的绝对浓度。 【试剂与器材】 1．巴 比妥缓 冲液 (pH8.6，离 子强度 0.06) 称 取巴 比妥钠 12.36g 、巴比妥 2.21g，于 500ml 蒸馏水中加热溶解，冷却至室温后，用蒸馏水定容至 1L

2.染色液(1）丽春红S染色液：称取丽春红S0.4g、三氯醋酸6g，溶于蒸馏水中并定容至100ml(2)氨基黑10B染色液：①第一种配方(推荐配方)：称取氨基黑10B0.1g，溶于20ml无水乙醇中，加冰醋酸5ml，甘油0.5ml；另取磺柳酸2.5g溶于少量蒸馏水中，加入前液，混和摇匀，再以蒸馏水补足至100ml。②第二种配方：称取氨基黑10B0.5g溶解于50ml甲醇中，加入冰醋酸10ml和蒸馏水40ml，混合即成3.漂洗液(I)3%(V/V)醋酸溶液，适用于丽春红S染色的漂洗。(2）甲醇45ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml，混匀。适用于氨基黑10B染色的漂洗。4.透明液(）液体石蜡或氢萘的润湿透明法，均十分方便。(2）冰醋酸95%乙醇=2.7:7.5的混合液。(3)N-甲基-2-吡咯烷酮-柠檬酸(3.03mol/LN-甲基-2-吡咯烷酮，0.15mol/L柠檬酸）：称取柠檬酸15g溶于150ml水中，加入N-甲基-2-吡咯烷酮150ml，混匀，加蒸馏水至500ml5.洗脱液(I)0.1mol/LNaOH溶液，适用于丽春红S染色的洗脱。(2)0.4mol/LNaOH溶液，适用于氨基黑10B染色的洗脱6.电泳仪电子管或品体管整流的直流电源，电压0~600V，电流0~300mA。7.电泳槽铂（白金）丝电极的水平电泳槽。8.加样器血红蛋白管和0.2cm×1.5cm有机玻璃片或x线胶片或特制电泳加样器。9.染色皿、漂洗皿、镊子。10．光密度计、721分光光度计。11.醋酸纤维素薄膜规格2cmX×8cm(比色法)，6cm×8cm(扫描法)。2

2 2．染色液 (1) 丽春红 S 染色液：称取丽春红 S 0.4g、三氯醋酸 6g，溶于蒸馏水中并定容至 100ml。 (2) 氨基黑 10B 染色液：①第一种配方(推荐配方)：称取氨基黑 10B 0.1g，溶于 20ml 无水乙醇中，加冰醋酸 5ml，甘油 0.5ml；另取磺柳酸 2.5g 溶于少量蒸馏水 中，加入前液，混和摇匀，再以蒸馏水补足至 100ml。②第二种配方：称取氨基黑 10B 0.5g 溶解于 50ml 甲醇中，加入冰醋酸 10ml 和蒸馏水 40ml，混合即成。 3．漂洗液 (1) 3%(V/V)醋酸溶液，适用于丽春红 S 染色的漂洗。 (2) 甲醇 45ml，冰醋酸 5ml，蒸馏水 50ml，混匀。适用于氨基黑 10B 染色的漂 洗。 4．透明液 (1) 液体石蜡或氢萘的润湿透明法，均十分方便。 (2) 冰醋酸 95%乙醇=2.7:7.5 的混合液。 (3) N-甲基-2-吡咯烷酮-柠檬酸(3.03mol/L N-甲基-2-吡咯烷酮，0.15mol/L 柠檬 酸)：称取柠檬酸 15g 溶于 150ml 水中，加入 N-甲基-2-吡咯烷酮 150ml，混匀，加 蒸馏水至 500ml。 5．洗脱液 (1) 0.1mol/L NaOH 溶液，适用于丽春红 S 染色的洗脱。 (2) 0.4mol/L NaOH 溶液，适用于氨基黑 10B 染色的洗脱。 6．电泳仪 电子管或晶体管整流的直流电源，电压 0~600V，电流 0~300mA。 7．电泳槽 铂(白金)丝电极的水平电泳槽。 8．加样器 血红蛋白管和 0.2cm×1.5cm 有机玻璃片或 X 线胶片或特制电泳加样 器。 9．染色皿、漂洗皿、镊子。 10．光密度计、721 分光光度计。 11．醋酸纤维素薄膜 规格 2cm×8cm(比色法)，6cm×8cm(扫描法)

【操作步骤】1.准备（1）电泳槽准备：将电泳槽置于水平平台上，两侧注入等量的巴比妥缓冲液，使其在同一水平面，液面与支架距离约2~2.5cm，支架宽度调节在5.5~6cm，用三层滤纸或双层纱布搭桥。(2)CAM的准备：选择厚薄一致，透水性能好的CAM，在无光泽面一端1.5cm处用铅笔轻划一横线作点样标记。然后将CAM无光泽面朝下，漂浮于盛有巴比妥缓冲液的平皿中，使之自然浸湿下沉，待充分浸透后(约20min)用镊子取出。2.点样（1）将薄膜条置于洁净滤纸中间，无光泽面朝上，用滤纸轻按吸去CAM上多余的缓冲液。(2)）用血红蛋白吸管取待测新鲜血清3~5u1，均匀涂布于点样用有机玻璃片或x线胶片上，或用加样器蘸少许血清，垂直印在CAM无光滑面划线处，待血清完全渗入薄膜后移开。3.电泳（1）将加样后的薄膜平直架于支架两端，无光泽面朝下，点样侧置于阴极端，用滤纸或纱布将膜的两端与缓冲液连通，平衡5min。(2）将电泳槽的正极和负极分别与电泳仪的正极和负极联结，打开电源，调电压为8~15V/cm膜长或电流0.3~0.5mA/cm膜宽。夏季通电45min，冬季通电60min。待电泳区带展开约3.5~4.0cm，即可关闭电源。4．染色用镊子取出薄膜条直接投入丽春红S或氨基黑10B染色液中染色5~10min。染色过程中不时轻轻晃动染色皿，使染色充分。薄膜条较多时，应避免彼此紧贴致染色不良。5.漂洗准备3~4个漂洗皿，装入漂洗液，从染色液中取出薄膜条并尽量沥去染色液，按顺序投入漂洗液中反复漂洗，直至背景无色为止。6.定量(1)洗脱比色法

3 【操作步骤】 1．准备 (1) 电泳槽准备：将电泳槽置于水平平台上，两侧注入等量的巴比妥缓冲液，使 其在同一水平面，液面与支架距离约 2~2.5cm，支架宽度调节在 5.5~6cm，用三层滤 纸或双层纱布搭桥。 (2) CAM 的准备：选择厚薄一致，透水性能好的 CAM，在无光泽面一端 1.5cm 处用铅笔轻划一横线作点样标记。然后将 CAM 无光泽面朝下，漂浮于盛有巴比妥缓 冲液的平皿中，使之自然浸湿下沉，待充分浸透后(约 20min)用镊子取出。 2．点样 (1) 将薄膜条置于洁净滤纸中间，无光泽面朝上，用滤纸轻按吸去 CAM 上多余 的缓冲液。 (2) 用血红蛋白吸管取待测新鲜血清 3~5μl，均匀涂布于点样用有机玻璃片或 X 线胶片上，或用加样器蘸少许血清，垂直印在 CAM 无光滑面划线处，待血清完全渗 入薄膜后移开。 3．电泳 (1) 将加样后的薄膜平直架于支架两端，无光泽面朝下，点样侧置于阴极端，用 滤纸或纱布将膜的两端与缓冲液连通，平衡 5min。 (2) 将电泳槽的正极和负极分别与电泳仪的正极和负极联结，打开电源，调电压 为 8~15V/cm 膜长或电流 0.3~0.5mA/cm 膜宽。夏季通电 45min，冬季通电 60min。 待电泳区带展开约 3.5~4.0cm，即可关闭电源。 4．染色 用镊子取出薄膜条直接投入丽春红 S 或氨基黑 10B 染色液中染色 5~10min。染色过程中不时轻轻晃动染色皿，使染色充分。薄膜条较多时，应避免彼 此紧贴致染色不良。 5．漂洗 准备 3~4 个漂洗皿，装入漂洗液，从染色液中取出薄膜条并尽量沥去 染色液，按顺序投入漂洗液中反复漂洗，直至背景无色为止。 6．定量 (1) 洗脱比色法

1）氨基黑10B染色法：将各蛋白区带仔细剪下，分别置于各试管内，另从空白背景剪一块平均大小的膜条置于空白管中，在白蛋白管内加入0.4mol/LNaOH溶液6ml(计算时吸光度乘2)，其余各管加入3ml，于37℃水浴20min，并不断摇动，待颜色脱净后，取出冷却。用620nm比色，以空白管调零，读取各管吸光度值。2）丽春红S染色法：用0.1mol/LNaOH溶液脱色，加入量同上，10min后，向白蛋白管中加入40%(v/v)醋酸0.6ml(计算时吸光度乘2)，其余各管加0.3ml，以中和部分NaOH，使色泽加深。用520nm比色，以空白管调零，读取各管吸光度值(2)光密度计扫描法1）透明：不保留的电泳图可用液体石蜡或氢萘浸透后，取出夹在两块优质的薄玻璃间，供扫描用；要保留的电泳图可用冰醋酸乙醇法或N-甲基-2-吡咯烷酮-柠檬酸法透明。将薄膜放入透明液中2~3min(延长一些时间亦无碍），然后取出，以滚动方式平贴于洁净无划痕的载玻璃片上(勿产生气泡)，将此玻片竖立片刻，除去一定的透明液后，于70~80℃（N-甲基-2-咯烷酮-柠檬酸法透明，90~100℃）烘烤15~20min，取出冷却至室温，即可透明。2）扫描定量：将已透明的薄膜置光密度计的暗箱内，选择波长520nm，描记各蛋白区带峰，并计算各蛋白成分的相对百分含量【计算】各组分蛋白质%=Ax×100Ax表示各个组分蛋白质(Alb、α1、α2、β和-球蛋白)吸光度。At表示各组分蛋白质的吸光度总和。各组分蛋白质绝对浓度(g/L)=血清总蛋白(g/L)×各组分蛋白质百分浓度(%)【参考范围】每个实验室应根据不同的实验条件和检测对象设定参考范围，表3-1、3-2和3-3的参考范围仅供参考

4 1) 氨基黑 10B 染色法：将各蛋白区带仔细剪下，分别置于各试管内，另从空白 背景剪一块平均大小的膜条置于空白管中，在白蛋白管内加入 0.4mol/L NaOH 溶液 6ml(计算时吸光度乘 2)，其余各管加入 3ml，于 37℃水浴 20min，并不断摇动，待 颜色脱净后，取出冷却。用 620nm 比色，以空白管调零，读取各管吸光度值。 2) 丽春红 S 染色法：用 0.1mol/L NaOH 溶液脱色，加入量同上，10min 后，向 白蛋白管中加入 40%(v/v)醋酸 0.6ml(计算时吸光度乘 2 )，其余各管加 0.3ml，以中 和部分 NaOH，使色泽加深。用 520nm 比色，以空白管调零，读取各管吸光度值。 (2) 光密度计扫描法 1) 透明：不保留的电泳图可用液体石蜡或氢萘浸透后，取出夹在两块优质的薄 玻璃间，供扫描用；要保留的电泳图可用冰醋酸乙醇法或 N-甲基-2-吡咯烷酮-柠檬酸 法透明。将薄膜放入透明液中 2~3min(延长一些时间亦无碍)，然后取出，以滚动方 式平贴于洁净无划痕的载玻璃片上(勿产生气泡)，将此玻片竖立片刻，除去一定的透 明 液 后 ， 于 70~80 ℃ （ N- 甲 基 -2- 吡 咯 烷 酮 - 柠 檬 酸 法 透 明 ， 90~100 ℃）烘烤 15~20min，取出冷却至室温，即可透明。 2) 扫描定量：将已透明的薄膜置光密度计的暗箱内，选择波长 520 nm，描记各 蛋白区带峰，并计算各蛋白成分的相对百分含量。 【计算】 100 A A T X 各组分蛋白质％＝  AX 表示各个组分蛋白质(Alb、1、2、β和γ-球蛋白)吸光度。 AT 表示各组分蛋白质的吸光度总和。 各组分蛋白质绝对浓度(g/L)＝血清总蛋白(g/L)×各组分蛋白质百分浓度(%) 【参考范围】 每个实验室应根据不同的实验条件和检测对象设定参考范围，表 3-1、3-2 和 3-3 的参考范围仅供参考

表3-1丽春红S染色直接扫描参考范围蛋白质组分g/L占总蛋白的百分数(%)白蛋白35~5257~68α1-球蛋白1.0~4.01.0~5.7α2一球蛋白4.0~8.04.9~11.2β-球蛋白5.0~10.07.0~13.0丫一球蛋白6.0~13.09.8~18.2表3-2氨基黑10B染色洗脱法参考范围蛋白质组分占总蛋白的百分数(%)白蛋白57.45~71.73α1球蛋白1.76~4.48α2一球蛋白4.04~8.28β一球蛋白6.79~11.39一球蛋白11.18~22.97表3-3氨基黑10B染色直接扫描法参考值蛋白质组分g/L占总蛋白的百分数(%)白蛋白48.8±5.166±6.62.0± 1.0α1-球蛋白1.5 ± 1.1α2一球蛋白3.9±1.45.3±2.0β一球蛋白6.1±2.18.3±1.6丫一球蛋白13.1 ± 5.517.7± 5.8【临床意义】正常血清蛋白电泳一般可分为5条区带，即Alb、αi、α2、β和-球蛋白。脐带血清、胎儿血清、部分原发性肝癌血清，在Alb与αi-球蛋白之间可增加一条甲胎蛋白带。多发性骨髓瘤可分离出6条区带，多出的1条称为M蛋白带。在下列疾病中可见醋纤膜蛋白电泳图明显异常

5 表 3-1 丽春红 S 染色直接扫描参考范围 蛋白质组分 g/L 占总蛋白的百分数(%) 白蛋白 35～52 57～68 1－球蛋白 1.0～4.0 1.0～5.7 2－球蛋白 4.0～8.0 4.9～11.2 β－球蛋白 5.0～10.0 7.0～13.0 γ－球蛋白 6.0～13.0 9.8～18.2 表 3-2 氨基黑 10B 染色洗脱法参考范围 蛋白质组分 占总蛋白的百分数(%) 白蛋白 57.45～71.73 1－球蛋白 1.76～4.48 2－球蛋白 4.04～8.28 β－球蛋白 6.79～11.39 γ－球蛋白 11.18～22.97 表 3-3 氨基黑 10B 染色直接扫描法参考值 蛋白质组分 g/L 占总蛋白的百分数(%) 白蛋白 48.8±5.1 66±6.6 1－球蛋白 1.5±1.1 2.0±1.0 2－球蛋白 3.9±1.4 5.3±2.0 β－球蛋白 6.1±2.1 8.3±1.6 γ－球蛋白 13.1±5.5 17.7±5.8 【临床意义】 正常血清蛋白电泳一般可分为 5 条区带，即 Alb、1、2、β和 γ-球蛋白。脐带血清、胎儿血清、部分原发性肝癌血清，在 Alb 与1-球蛋白之间 可增加一条甲胎蛋白带。多发性骨髓瘤可分离出 6 条区带，多出的 1 条称为 M 蛋白 带。在下列疾病中可见醋纤膜蛋白电泳图明显异常

1.M蛋白血症单克隆球蛋白(M蛋白)血症，主要见于多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、重链病以及一些良性M蛋白增多症。在β与球蛋白后区段的各部分出现条致密浓集的M蛋白带。2.蛋白缺乏症主要包括α1抗胰蛋白酶缺乏症、球蛋白缺乏症等。临床上较少见。电泳图型表现为α1或球蛋白部位蛋白缺乏或显著降低。3.肾病见于急慢性肾炎、肾病综合症、肾功能衰竭等。表现为Alb 降低，α2和β升高。4.急慢性炎症表现为α1、α2和β三种球蛋白均增高。5.肝病包括急慢性肝炎和肝硬化。主要表现为AIb降低、β和球蛋白增高，出现β和难分离而相连的“β～桥”，此现象往往是由于IgA增高所致，IgA与肝脏纤维化有关。【注意事项】1.通电时，不得接触槽内缓冲液或CAM，以防触电。2.CAM在电泳前，必须浸泡在巴比妥缓冲液中，使薄膜浸泡透彻3．缓冲液液面要保证一定高度，同时电泳槽两侧的液面应保持同一水平，否则通过薄膜时有虹吸现象，会影响蛋白质分子的泳动速度。4.电泳常见的缓冲液为巴比妥缓冲液，用硼砂，Tris和EDTA组成的缓冲液可以分离出前白蛋白，三种α-球蛋白，三种β-球蛋白和-球蛋白。5.电泳后区带应无拖尾，各区带明显分开，如果电泳图谱分离不清或不整齐，最常见的原因有：①点样过多；②点样不均匀、不整齐，样品触及薄膜边缘；③薄膜过湿，样品扩散；④薄膜未完全浸透或温度过高导致局部干燥或水分蒸发；③薄膜与滤纸桥接触不良；③薄膜位置歪斜、弯曲，与电流方向不平行；缓冲液变质；③样品不新鲜；CAM质量不高等。6．染料问题染料的选择应对蛋白质的各组分亲和力相同，吸光度与蛋白质的浓度成正比。并要求水溶性好、染料稳定、吸光度敏感，形成的染料蛋白质复合物稳定且易洗脱比色。现在常用丽春红S、氨基黑10B和尼基黑作为染料，其中尼基黑对蛋白质吸光度比氨基黑10B敏感3倍以上。用光密度计扫描定量一般用丽春红S染6

6 1．M 蛋白血症 单克隆γ球蛋白(M 蛋白)血症，主要见于多发性骨髓瘤、巨球蛋 白血症、重链病以及一些良性 M 蛋白增多症。在β与γ球蛋白后区段的各部分出现 一条致密浓集的 M 蛋白带。 2．蛋白缺乏症 主要包括1 抗胰蛋白酶缺乏症、γ球蛋白缺乏症等。临床上较 少见。电泳图型表现为1 或γ球蛋白部位蛋白缺乏或显著降低。 3．肾病 见于急慢性肾炎、肾病综合症、肾功能衰竭等。表现为 Alb 降低，2 和β升高。 4．急慢性炎症 表现为1、2 和β三种球蛋白均增高。 5．肝病 包括急慢性肝炎和肝硬化。主要表现为 Alb 降低、β和γ球蛋白增 高，出现β和γ难分离而相连的“β~γ桥”，此现象往往是由于 IgA 增高所致，IgA 与肝脏纤维化有关。 【注意事项】 1．通电时，不得接触槽内缓冲液或 CAM，以防触电。 2．CAM 在电泳前，必须浸泡在巴比妥缓冲液中，使薄膜浸泡透彻。 3．缓冲液液面要保证一定高度，同时电泳槽两侧的液面应保持同一水平，否则 通过薄膜时有虹吸现象，会影响蛋白质分子的泳动速度。 4．电泳常见的缓冲液为巴比妥缓冲液，用硼砂，Tris 和 EDTA 组成的缓冲液可 以分离出前白蛋白，三种-球蛋白，三种β-球蛋白和γ-球蛋白。 5．电泳后区带应无拖尾，各区带明显分开，如果电泳图谱分离不清或不整齐， 最常见的原因有：①点样过多；②点样不均匀、不整齐，样品触及薄膜边缘；③薄膜 过湿，样品扩散；④薄膜未完全浸透或温度过高导致局部干燥或水分蒸发；⑤薄膜与 滤纸桥接触不良；⑥薄膜位置歪斜、弯曲，与电流方向不平行；⑦缓冲液变质；⑧样 品不新鲜；⑨CAM 质量不高等。 6．染料问题 染料的选择应对蛋白质的各组分亲和力相同，吸光度与蛋白质的 浓度成正比。并要求水溶性好、染料稳定、吸光度敏感，形成的染料蛋白质复合物稳 定且易洗脱比色。现在常用丽春红 S、氨基黑 10B 和尼基黑作为染料，其中尼基黑对 蛋白质吸光度比氨基黑 10B 敏感 3 倍以上。用光密度计扫描定量一般用丽春红 S 染

色，比色法定量既可用丽春红S也可用氨基黑10B染色。在血清蛋白正常浓度范围内，丽春红S能与各蛋白质组分成正比例结合而氨基黑10B却对白蛋白染色过深导致白蛋白结果偏高，球蛋白偏低。7.血清加量标本应新鲜，不得溶血。如为扫描法，丽春红S染色加入血清量在0.5~1.0μ1/cm，氨基黑10B染色加1~1.5u1/cm。如血清总蛋白含量超过80g/L，用氨基黑10B染色时应将血清稀释2倍后加样。若不稀释，白蛋白中蛋白含量太高，区带染色不透，反而出现空泡，甚至蛋白膜脱落在染色液中，致使定量不准确，【评价】1.优点CAM电泳具有灵敏度高，标本用量少，分辨率高，区带清晰，电泳时间短，操作简便快捷；CAM对染料不吸附，蛋白区带均匀，背景清晰，既易比色定量，又易透明后进行光密度扫描2.缺点有轻微电渗现象，薄膜吸水性差，电阻容易增大：当电流较大时，薄膜中水分极易蒸发，造成蛋白质分子变性破坏。附：聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质【原理】聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)普遍运用于分离蛋白质及较小分子的核酸。其基本方式有两种：圆盘电泳(disc-electrophoresis)和平板电泳(slab-electrophoresis)。不论圆盘电泳或平板电泳都有连续和不连续电泳之分。电泳在电极缓冲液、凝胶缓冲液、凝胶孔径一致的体系中进行，称为连续PAGE电泳在电极缓冲液、凝胶缓冲液pH值不同、凝胶孔径不同的体系中进行，称为不连续PAGE。不连续PAGE分离中包括三和物理效应：样品的浓缩效应、电泳分离的电荷效应和分子筛效应。而连续PAGE则不具备浓缩效应。本实验介绍不连续聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳【试剂及器材】1.分离胶缓冲液(pH8.9）称取Tris36.3g，1mol/LHCI溶液48ml，加蒸馏水80ml使其溶解，pH调至8.9，用蒸馏水定容至100ml，置棕色瓶中，4℃冰箱保存。2.浓缩胶缓冲液(pH6.7）称取Tris5.98g，1mol/LHCI溶液48ml，加蒸馏水至80ml使其溶解，pH调至6.7，用蒸馏水定容至100ml，置棕色瓶中，4℃冰箱保存

7 色，比色法定量既可用丽春红 S 也可用氨基黑 10B 染色。在血清蛋白正常浓度范围 内，丽春红 S 能与各蛋白质组分成正比例结合而氨基黑 10B 却对白蛋白染色过深， 导致白蛋白结果偏高，球蛋白偏低。 7．血清加量 标本应新鲜，不得溶血。如为扫描法，丽春红 S 染色加入血清量 在 0.5~1.0μl/cm，氨基黑 10B 染色加 1~1.5μl/cm。如血清总蛋白含量超过 80g/L， 用氨基黑 10B 染色时应将血清稀释 2 倍后加样。若不稀释，白蛋白中蛋白含量太 高，区带染色不透，反而出现空泡，甚至蛋白膜脱落在染色液中，致使定量不准确。 【评价】 1．优点 CAM 电泳具有灵敏度高，标本用量少，分辨率高，区带清晰，电泳时 间短，操作简便快捷；CAM 对染料不吸附，蛋白区带均匀，背景清晰，既易比色定 量，又易透明后进行光密度扫描。 2．缺点 有轻微电渗现象，薄膜吸水性差，电阻容易增大；当电流较大时，薄 膜中水分极易蒸发，造成蛋白质分子变性破坏。 附：聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质 【原理】 聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel el ectrophoresis，PAGE)普遍运用于分 离蛋白质及较小分子的核酸。其基本方式有两种：圆盘电泳(disc-electrophoresis) 和平板电泳 (slab-electrophoresis)。不论圆盘电泳或平板电泳都有连续和不连续电泳之分。电泳在电极缓冲 液、凝胶缓冲液、凝胶孔径一致的体系中进行，称为连续 PAGE；电泳在电极缓冲液、凝胶缓冲 液 pH 值不同、凝胶孔径不同的体系中进行，称为不连续 PAGE。不连续 PAGE 分离中包括三种 物理效应：样品的浓缩效应、电泳分离的电荷效应和分子筛效应。而连续 PAGE 则不具备浓缩 效应。本实验介绍不连续聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳。 【试剂及器材】 1．分离胶缓冲液(pH8.9) 称取 Tris 36.3g，1mol/L HCl 溶液 48ml，加蒸馏水 80ml 使其溶 解，pH 调至 8.9，用蒸馏水定容至 100ml，置棕色瓶中，4℃冰箱保存。 2．浓缩胶缓冲液(pH6.7) 称取 Tris 5.98g，1mol/L HCl 溶液 48ml，加蒸馏水至 80ml 使其 溶解，pH 调至 6.7，用蒸馏水定容至 100ml，置棕色瓶中，4℃冰箱保存

3.凝胶贮备液(30%单体交联剂）称取丙烯酰胺(Acr）29.2g，甲叉双丙烯酰胺(Bis）0.8g加蒸馏水溶解后定容至100ml，过滤，将未溶物滤去，盛于棕色瓶中，4℃冰箱保存，可使用个月。4.电极缓冲液（pH8.3）称取甘氨酸28.8g，Tris6.0g，加蒸馏水至850ml，调pH至8.3，用蒸馏水定容至1000ml，4℃冰箱保存，用时可作10倍稀释。5.催化剂（10%过硫酸铵）称取过硫酸铵0.5g，加蒸馏水5ml。临用前配制，若4℃冰箱存放，最长不超过1周。6.加速剂（四甲基乙二胺，TEMED）原包装液，存于4℃冰箱备用。7.染色液称取考马斯亮蓝R-250(CBBR-250)1.25g，加入50%甲醇454ml溶解，再加入冰醋酸46ml，混匀。8.固定液12.5%三氯醋酸(TCA)。9.洗脱液取冰醋酸30ml，甲醇125ml，用蒸馏水定容至500ml。10.保存液7%冰醋酸。12.0.05%溴酚蓝。13.电泳仪选用电子管或晶体管整流电源。电压0~600V，电流0~300mA。14.电泳槽圆柱型垂直电泳槽。15.凝胶玻管0.5~0.6cm×10cm。16.小烧杯，50u1微量进样器，10cm长针头或腰椎穿刺针头，5或10ml注射器。【操作步骤】1.制备凝胶柱（1）取已准备好的0.6cm×10cm玻管，从一端量至7cm和7.5cm两处，用玻璃蜡笔划线，插入橡皮垫后垂直置于小试管中。（2）配制分离胶：取一小烧杯，按表3-4加入各液，摇匀，此液总体积为10ml，凝胶浓度为7.5%。用5ml注射器、长针头或用毛细滴管吸取分离胶液，沿管壁注入玻管至7cm划线处，小心在凝胶液面上覆盖一层蒸馏水（约0.5cm高），尽量避免冲击凝胶液面。待凝胶与水交界面可见一分界线后，倾去覆盖的水并用滤纸条吸干。（3）配制浓缩胶：按表3-4加入各液，摇匀。总体积为10ml，凝胶浓度为3.0%。按上法沿壁注入凝胶管至7.5cm处，再沿管壁加入蒸馏水（约0.5cm高)。待聚合后倾去并吸干蒸馏水，准

8 3．凝胶贮备液(30%单体交联剂) 称取丙烯酰胺(Acr) 29.2g，甲叉双丙烯酰胺(Bis) 0.8g， 加蒸馏水溶解后定容至 100ml，过滤，将未溶物滤去，盛于棕色瓶中，4℃冰箱保存，可使用 1 个月。 4．电极缓冲液(pH8.3) 称取甘氨酸 28.8g，Tris 6.0g，加蒸馏水至 850ml，调 pH 至 8.3， 用蒸馏水定容至 1000ml，4℃冰箱保存，用时可作 10 倍稀释。 5．催化剂(10%过硫酸铵) 称取过硫酸铵 0.5g，加蒸馏水 5ml。临用前配制，若 4℃冰箱存 放，最长不超过 1 周。 6．加速剂(四甲基乙二胺，TEMED) 原包装液，存于 4℃冰箱备用。 7．染色液 称取考马斯亮蓝 R-250(CBBR-250)1.25g，加入 50%甲醇 454ml 溶解，再加入 冰醋酸 46ml，混匀。 8．固定液 12 .5%三氯醋酸(TCA)。 9．洗脱液 取冰醋酸 30ml，甲醇 125ml，用蒸馏水定容至 500ml。 10．保存液 7%冰醋酸。 12．0.05%溴酚蓝。 13．电泳仪 选用电子管或晶体管整流电源。电压 0~600V，电流 0~300mA。 14．电泳槽 圆柱型垂直电泳槽。 15．凝胶玻管 0.5~0.6cm×10cm。 16．小烧杯，50μl 微量进样器，10cm 长针头或腰椎穿刺针头，5 或 10ml 注射器。 【操作步骤】 1．制备凝胶柱 (1) 取已准备好的 0.6cm×10cm 玻管，从一端量至 7cm 和 7.5cm 两处，用玻璃蜡笔划线， 插入橡皮垫后垂直置于小试管中。 (2) 配制分离胶：取一小烧杯，按表 3-4 加入各液，摇匀，此液总体积为 10ml，凝胶浓度为 7.5%。用 5ml 注射器、长针头或用毛细滴管吸取分离胶液，沿管壁注入玻管至 7cm 划线处，小 心在凝胶液面上覆盖一层蒸馏水(约 0.5cm 高)，尽量避免冲击凝胶液面。待凝胶与水交界面可见 一分界线后，倾去覆盖的水并用滤纸条吸干。 (3) 配制浓缩胶：按表 3-4 加入各液，摇匀。总体积为 10ml，凝胶浓度为 3.0%。按上法沿 壁注入凝胶管至 7.5cm 处，再沿管壁加入蒸馏水(约 0.5cm 高)。待聚合后倾去并吸干蒸馏水，准

备加样。表3-4浓缩胶的配制试剂浓缩胶溶液(ml)分离胶溶液(ml)分离胶缓冲液1.251.25浓缩胶缓冲液一2.5 1.0单体交联剂6.197.65蒸馏水催化剂0.050.050.005加速剂0.0052.加样取血清0.1ml，40%蔗糖液0.1ml及0.05%溴酚兰0.1ml(作示踪染料)于一小试管中混匀，用微量加样器吸取10μ1加到玻管浓缩胶表面，相当于加血清3.3u1。3.电泳（1）将已加样的凝胶管安装在电泳槽上的橡皮孔中，使凝胶顶部恰好可见，并弃掉下端的橡皮垫。（2）用毛细滴管吸电极缓冲液，小心注满凝胶玻管（不能搅动样品层）。然后将电极缓冲液慢慢倒入上、下电极槽中，上槽应浸没凝胶玻璃管，下槽液面应超过凝胶玻管下端。小心排除凝胶管的上、下管口内可能存在的气泡，否则会影响导电。（3）将上槽的电极接电泳仪的负极，下端接正极，通电。先调节电流为1mA/管，待示踪染料进入分离胶后，再调节电流为2mA/管。待示踪染料达到玻管下口约0.5cm时，切断电源，电泳完毕。4．剥胶取下凝胶管，用带10cm长针头的注射器吸满蒸馏水。将针头小心插入胶柱与管壁之间，一边注水一边旋转玻管，靠水流压力和润滑力将玻管内壁与凝胶分开，然后用洗耳球在胶管一端轻轻加压，凝胶柱便缓缓从玻管中滑出。5.固定、染色将凝胶柱浸泡于12.5%的TCA中0.5~1h，然后转入CBBR-250染色液中染色1~2h，或90℃水浴中染色10min。6．脱色、保存将已染色的凝胶柱置于7%冰醋酸溶液中浸洗，不断更新冰醋酸，直到浸洗无色为止。全过程约需5~7d。或用洗脱液漂洗3~4次，每次20~30min。取1cm×15cm小试管，内盛7%冰醋酸溶液，把凝胶柱浸泡其中，加塞蜡封即可长期保存。7.定量9

9 备加样。 表 3-4 浓缩胶的配制 试剂 分离胶溶液(ml) 浓缩胶溶液(ml) 分离胶缓冲液 1.25 － 浓缩胶缓冲液 － 1.25 单体交联剂 2.5 1.0 蒸馏水 6.19 7.65 催化剂 0.05 0.05 加速剂 0.005 0.005 2．加样 取血清 0.1ml，40%蔗糖液 0.1ml 及 0.05%溴酚兰 0.1ml(作示踪染料)于一小试管 中混匀，用微量加样器吸取 10μl 加到玻管浓缩胶表面，相当于加血清 3.3μl。 3．电泳 (1) 将已加样的凝胶管安装在电泳槽上的橡皮孔中，使凝胶顶部恰好可见，并弃掉下端的橡 皮垫。 (2) 用毛细滴管吸电极缓冲液，小心注满凝胶玻管(不能搅动样品层) 。然后将电极缓冲液慢 慢倒入上、下电极槽中，上槽应浸没凝胶玻璃管，下槽液面应超过凝胶玻管下端。小心排除凝胶 管的上、下管口内可能存在的气泡，否则会影响导电。 (3) 将上槽的电极接电泳仪的负极，下端接正极，通电。先调节电流为 1mA/管，待示踪染 料进入分离胶后，再调节电流为 2mA/管。待示踪染料达到玻管下口约 0.5cm 时，切断电源，电 泳完毕。 4．剥胶 取下凝胶管，用带 10cm 长针头的注射器吸满蒸馏水。将针头小心插入胶柱与管壁 之间，一边注水一边旋转玻管，靠水流压力和润滑力将玻管内壁与凝胶分开，然后用洗耳球在胶 管一端轻轻加压，凝胶柱便缓缓从玻管中滑出。 5．固定、染色 将凝胶柱浸泡于 12.5%的 TCA 中 0.5~1h，然后转入 CBBR-250 染色液中 染色 1~2h，或 90℃水浴中染色 10min。 6．脱色、保存 将已染色的凝胶柱置于 7%冰醋酸溶液中浸洗，不断更新冰醋酸，直到浸洗 无色为止。全过程约需 5～7d。或用洗脱液漂洗 3～4 次，每次 20～30min。取 1cm×15cm 小 试管，内盛 7%冰醋酸溶液，把凝胶柱浸泡其中，加塞蜡封即可长期保存。 7．定量

(1）切片抽提法：切割特定区域的片段，用10倍量的水或0.1~0.2mol/LNaCI或适量的缓冲液进行匀浆。4℃过夜抽提，离心取上清液，选择合适的波长测定吸光度值。这种定量方法准确性不高，可作为样品的回收方法。（2）微量光密度计法：目前已有不经染色直接进行紫外扫描的微量光密度计，也有必需经过染色后进行测定的光密度计，还有配备显微装置的超微量光密度计。为了消除圆柱状凝胶的球面差，可将胶条放入7%冰醋酸内进行测定。【临床意义】参见实验9【注意事项】1.Acr和Bis是神经毒剂，可经皮肤、呼吸道等吸收，操作时要注意保护。2.Acr和Bis在低温下稳定，应放棕色瓶干燥低温(4℃)保存。30%单体交联剂应装棕色瓶中，贮存于冰箱（4℃）能部分地防止水解，但也只能保存1~2月。可测定pH值（4.9~5.2)来检查是否失效，失效液不能聚合。3.在制胶过程中用蒸馏水封住胶面是为了阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。4.TEMED宜密封避光保存。5．制备凝胶用玻管要用洗液浸泡清洁，如玻管不清洁，倒胶后在管壁会出现气泡6.制备分离胶和浓缩胶时，加入催化剂和加速剂混合后约在10~30min内聚合，故应尽快注入玻管。如室温过高，为防止过快聚合，可置冰浴中操作。如果凝胶不聚合，通常是由于制备的试剂浓度不准确，或者凝胶混合液中漏加某一试剂，也可能是试剂不纯所致。应重新配制混合液。7.本法可简化，用同一分离胶以及同一缓冲液和 pH值的连续凝胶电泳，也可获得较好的结果。【评价】聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶强度好，对热稳定，无电渗作用，透明度高，且凝胶孔径大小可调节，所需样品量小，并具有高分辨率等多种优点。其中圆盘电泳设备简单，操作方便。但平板电泳可用于同时对多个样品的比较分析，而且结合十二烷基硫酸钠(SDS）形成SDS-PAGE，或者与等电聚焦（IEF）配合作IEF-PAGE的双向电泳，均可进一步提高其分辨率及扩大应用范围。10

10 (1) 切片抽提法：切割特定区域的片段，用 10 倍量的水或 0.1~0.2 mol/L NaCl 或适量的缓 冲液进行匀浆。4℃过夜抽提，离心取上清液，选择合适的波长测定吸光度值。这种定量方法准 确性不高，可作为样品的回收方法。 (2) 微量光密度计法：目前已有不经染色直接进行紫外扫描的微量光密度计，也有必需经过 染色后进行测定的光密度计，还有配备显微装置的超微量光密度计。为了消除圆柱状凝胶的球面 差，可将胶条放入 7%冰醋酸内进行测定。 【临床意义】 参见实验 9 【注意事项】 1．Acr 和 Bis 是神经毒剂，可经皮肤、呼吸道等吸收，操作时要注意保护。 2．Acr 和 Bis 在低温下稳定，应放棕色瓶干燥低温(4℃)保存。30%单体交联剂应装棕色瓶 中，贮存于冰箱(4℃)能部分地防止水解，但也只能保存 1~2 月。可测定 pH 值(4.9~5.2)来检查 是否失效，失效液不能聚合。 3．在制胶过程中用蒸馏水封住胶面是为了阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。 4．TEMED 宜密封避光保存。 5．制备凝胶用玻管要用洗液浸泡清洁，如玻管不清洁，倒胶后在管壁会出现气泡。 6．制备分离胶和浓缩胶时，加入催化剂和加速剂混合后约在 10~30min 内聚合，故应尽快 注入玻管。如室温过高，为防止过快聚合，可置冰浴中操作。如果凝胶不聚合，通常是由于制备 的试剂浓度不准确，或者凝胶混合液中漏加某一试剂，也可能是试剂不纯所致。应重新配制混合 液。 7．本法可简化，用同一分离胶以及同一缓冲液和 pH 值的连续凝胶电泳，也可获得较好的 结果。 【评价】 聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶强度好，对热稳定，无电渗作用，透明度高，且凝胶孔 径大小可调节，所需样品量小，并具有高分辨率等多种优点。其中圆盘电泳设备简单，操作方 便。但平板电泳可用于同时对多个样品的比较分析，而且结合十二烷基硫酸钠(SDS)形成 SDS￾PAGE，或者与等电聚焦(IEF)配合作 IEF-PAGE 的双向电泳，均可进一步提高其分辨率及扩大应 用范围