《临床生物化学》课程教学资源（实验指导）第13章 非蛋白含氮化合物及总胆汁酸测定

第十三章非蛋白含氮化合物及总胆汁酸测定非蛋白含氮化合物包括除蛋白质以外的尿素、肌酐、肌酸、尿酸、氨基酸、核苷酸、嘌呤、谷胱甘肽等多种含氮有机物。临床上应用较多的有尿素、肌酐、尿酸和肌酸及它们的最终代谢产物氨，含血红素蛋白的代谢产物胆红素，以及肝脏合成的胆汁酸。尿素、肌酐、尿酸和肌酐清除率可作为肾小球滤过功能的指标，尿酸水平还能反映嘌呤代谢紊乱的情况；尿肌酸测定能反映肌肉损害性疾病。血氨是肝功能衰竭的指标，胆红素和胆汁酸可反映肝胆功能。第一节血清尿素测定检测尿素的方法有二乙酰一法、半酶法和全酶法。二乙酰一法需煮沸反应，检测精密度较差，目前临床实验室基本上已不使用。半酶法是直接或间接测定经脲酶作用后由尿素转变成的氨，氨的测定方法有：①离子选择性电极法：②用波氏比色法；③干化学法。脲酶波氏比色法在基层实验室较多用。全酶法用脲酶和谷氨酸脱氢酶偶联，使用连续监测法测定，可自动化，目前在多数医院普遍使用。实验 79二乙酰一法测定血清尿素【原理】二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的4，5-二甲基-2-氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。因二乙酰不稳定，故由试剂中二乙酰一与强酸作用产生二乙酰。【试剂】1.酸性试剂在三角烧瓶中加去离子水约100ml，然后加入浓硫酸44ml、85%磷酸66ml冷至室温，加入氨基硫脲50mg及硫酸镉(CdSO4·8H2O)2g，溶解后用去离子水稀释至1L。置棕色瓶中，4℃可保存半年。2.179.9mmo/L二乙酰一溶液称二乙酰一20g溶于去离子水中并定容至1L。置棕色瓶中，4℃可保存半年。3尿素标准贮存液(100mmol/L）精确称取于60~65℃干燥恒重的尿素(Mw为60.06)0.6g，溶解于无氮去离子水，并定容至100ml，加0.1g叠氮钠防腐，4℃可保存6个月。4.尿素标准应用液(5mmol/L）取5ml上述贮存液用无氨去离子水稀释至100ml。【操作步骤】按表13-1操作。1

1 第十三章 非蛋白含氮化合物及总胆汁酸测定 非蛋白含氮化合物包括除蛋白质以外的尿素、肌酐、肌酸、尿酸、氨基酸、核苷酸、嘌 呤、谷胱甘肽等多种含氮有机物。临床上应用较多的有尿素、肌酐、尿酸和肌酸及它们的最 终代谢产物氨，含血红素蛋白的代谢产物胆红素，以及肝脏合成的胆汁酸。 尿素、肌酐、尿酸和肌酐清除率可作为肾小球滤过功能的指标，尿酸水平还能反映嘌呤 代谢紊乱的情况；尿肌酸测定能反映肌肉损害性疾病。血氨是肝功能衰竭的指标，胆红素和 胆汁酸可反映肝胆功能。 第一节 血清尿素测定 检测尿素的方法有二乙酰一肟法、半酶法和全酶法。二乙酰一肟法需煮沸反应，检测精 密度较差，目前临床实验室基本上已不使用。半酶法是直接或间接测定经脲酶作用后由尿素 转变成的氨，氨的测定方法有：①离子选择性电极法；②用波氏比色法；③干化学法。脲酶 －波氏比色法在基层实验室较多用。全酶法用脲酶和谷氨酸脱氢酶偶联，使用连续监测法测 定，可自动化，目前在多数医院普遍使用。 实验 79 二乙酰一肟法测定血清尿素 【原理】 二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的 4，5-二甲基-2-氧咪唑化合物，颜 色深浅与尿素含量成正比。因二乙酰不稳定，故由试剂中二乙酰一肟与强酸作用产生二乙酰。 【试剂】 1．酸性试剂 在三角烧瓶中加去离子水约 100ml，然后加入浓硫酸 44ml、85%磷酸 66ml。 冷至室温，加入氨基硫脲 50mg 及硫酸镉(CdSO4·8H2O)2g，溶解后用去离子水稀释至 1L。 置棕色瓶中，4℃可保存半年。 2．179.9mmol/L 二乙酰一肟溶液 称二乙酰一肟 20g 溶于去离子水中并定容至 1L。置棕 色瓶中，4℃可保存半年。 3．尿素标准贮存液(100mmol/L) 精确称取于 60～65℃干燥恒重的尿素(Mw 为 60.06)0.6g，溶解于无氨去离子水，并定容至 100ml，加 0.1g 叠氮钠防腐，4℃可保存 6 个月。 4．尿素标准应用液(5mmol/L) 取 5ml 上述贮存液用无氨去离子水稀释至 100ml。 【操作步骤】 按表 13-1 操作

表13-1二乙酰一法操作步骤加入物(ml)空白管标准管测定管血清0.020.02 尿素标准应用液去离子水0.020.50.5二乙酰一溶液0.55.05.0酸性试剂5.0混匀，置沸水浴加热12min，取出置冷水中冷却5min，以空白管调零，在540nm处读取各管吸光度。【计算】尿素(mml /L)=会个期定×5A标【参考范围】血清尿素1.78~7.14mmol/L。【临床意义】1.血液尿素浓度增高分生理性和病理性因素两方面。(1）生理因素：高蛋白饮食引起血清尿素浓度和尿液排出量显著增高。血清尿素浓度男性比女性平均高0.3～0.5mmol/L，随年龄增加有增高倾向。成人日间生理变异平均为0.63mmol/L。(2)病理因素1）肾前性：最重要的原因是失水，因血液浓缩使肾血流量减少，肾小球滤过率减低而致血液尿素浓度增加2）肾性：肾小球肾炎、肾病晚期、肾功能衰竭、慢性肾孟肾炎及中毒性肾炎等影响肾小球滤过的疾病，都可使血液尿素含量增高3）肾后性疾病：所有使尿路阻塞的因素都可引起血液中尿素含量增高，如前列腺肿大、尿路结石、尿道狭窄、膀胱肿瘤致使尿道受压等。2．血尿素浓度降低除婴儿、孕妇以及低蛋白高糖饮食者外，常见于肝功能衰竭患者。【注意事项】1.试剂中加入氨基硫脲和镉离子，可增进显色强度和色泽稳定性，但仍有轻度褪色现象，（每小时小于5%)。煮沸显色经冷却后，应及时比色。2．尿液中尿素也可用此法测定，但因浓度高，需先用去离子水作50倍以上稀释。3.尿素浓度以前习惯用尿素氮mg/dl表示，因为一个尿素分子中有2个氮原子，所以1mmol尿素相当于28mg尿素氮(1mmol/L尿素相当于2.8mg/dL尿素氮)；另外还有以尿素氮

2 表 13-1 二乙酰一肟法操作步骤 加入物(ml) 空白管 标准管 测定管 血清 － － 0.02 尿素标准应用液 － 0.02 － 去离子水 0.02 － － 二乙酰一肟溶液 0.5 0.5 0.5 酸性试剂 5.0 5.0 5.0 混匀，置沸水浴加热 12min，取出置冷水中冷却 5min，以空白管调零，在 540nm 处读取 各管吸光度。 【计算】 5 A A (mmol / L) =  标准 尿素 测定 【参考范围】 血清尿素 1.78～7.14mmol/L。 【临床意义】 1．血液尿素浓度增高 分生理性和病理性因素两方面。 (1) 生理因素：高蛋白饮食引起血清尿素浓度和尿液排出量显著增高。血清尿素浓度男性 比女性平均高 0.3～0.5mmol/L，随年龄增加有增高倾向。成人日间生理变异平均为 0.63mmol/L。 (2) 病理因素 1) 肾前性：最重要的原因是失水，因血液浓缩使肾血流量减少，肾小球滤过率减低而致 血液尿素浓度增加。 2) 肾性：肾小球肾炎、肾病晚期、肾功能衰竭、慢性肾盂肾炎及中毒性肾炎等影响肾小 球滤过的疾病，都可使血液尿素含量增高。 3) 肾后性疾病：所有使尿路阻塞的因素都可引起血液中尿素含量增高，如前列腺肿大、 尿路结石、尿道狭窄、膀胱肿瘤致使尿道受压等。 2．血尿素浓度降低除婴儿、孕妇以及低蛋白高糖饮食者外，常见于肝功能衰竭患者。 【注意事项】 1．试剂中加入氨基硫脲和镉离子，可增进显色强度和色泽稳定性，但仍有轻度褪色现象， (每小时小于 5%)。煮沸显色经冷却后，应及时比色。 2．尿液中尿素也可用此法测定，但因浓度高，需先用去离子水作 50 倍以上稀释。 3．尿素浓度以前习惯用尿素氮 mg/dl 表示，因为一个尿素分子中有 2 个氮原子，所以 1mmol 尿素相当于 28mg 尿素氮(1mmol/L 尿素相当于 2.8mg/dL 尿素氮)；另外还有以尿素氮

mmol/L表示，则1mmol/L尿素=2mmol/L尿素氮。世界卫生组织推荐尿素用mmol/L表示我国卫生部临检中心也已规定一律使用此表示方法，不再用尿素氮一词。【评价】1．本法试剂单一，方法简便，但试剂具毒性和腐蚀性。在标本数量多时加热开始难以达到100℃，各管间受热温度也可能不一致，因而本法重复性不佳。若改善加热条件，如采用在水浴锅底部加置高约5mm的网垫，在网垫上加热显色，可使CV由不加网垫时的6.46%降至2.99%。2.线性上限仅达7.14mmol/L；回收率为96%~102.1%。3.二乙酰一法的主要干扰来自血清中存在的含氮化合物。很多其它化合物在结构中会有尿素的残基，如瓜氨酸、四氧嘧啶和尿囊素，虽然也会产生一种带颜色的产物，但这些化合物在血清中浓度很低，故很少引起明显的干扰。另一些其它的化合物在血清中浓度高，但这些色素的最大吸收峰不同，因此不产生明显干扰。胆红素达171umol/L、血红蛋白达10g/L均无影响。实验80脲酶一波氏比色法测定血清尿素【原理】脲酶水解尿素产生2分子氨和1分子二氧化碳，氨在碱性介质中与苯酚及次氯酸钠反应，生成蓝色的吲哚酚阴离子，此过程需用亚硝基铁氰化钠催化反应。蓝色吲哚酚的生成量与尿素含量成正比，在630nm波长处有吸收峰。【试剂】1．酚显色剂苯酚10g，亚硝基铁氰化钠(含2分子水)0.05g，溶于1L无氨去离子水中，存放4℃可保存2个月。2.碱性次氯酸钠溶液氢氧化钠5g溶于无氨去离子水中，加“安替福明”8ml(相当于次氯酸钠0.42g)，再加无氨去离子水至1L，置棕色瓶内，4℃可保存2个月。3.脲酶贮存液脲酶(比活性3000~4000U/g)0.2g置于20ml50%(V/V)甘油中，4℃可保存6个月。4.脲酶应用液发脲酶贮存液1ml，加10g/LEDTA-Na2溶液(pH6.5)至100ml，4℃保存可稳定1个月。5.尿素标准液(5.0mmol/L）见二乙酰一肟法。【操作步骤】按表13-2 操作。3

3 mmol/L 表示，则 1mmol/L 尿素＝2mmol/L 尿素氮。世界卫生组织推荐尿素用 mmol/L 表示， 我国卫生部临检中心也已规定一律使用此表示方法，不再用尿素氮一词。 【评价】 1．本法试剂单一，方法简便，但试剂具毒性和腐蚀性。在标本数量多时加热开始难以达 到 100℃，各管间受热温度也可能不一致，因而本法重复性不佳。若改善加热条件，如采用 在水浴锅底部加置高约 5mm 的网垫，在网垫上加热显色，可使 CV 由不加网垫时的 6.46%降 至 2.99%。 2．线性上限仅达 7.14mmol/L；回收率为 96%～102.1%。 3．二乙酰一肟法的主要干扰来自血清中存在的含氮化合物。很多其它化合物在结构中会 有尿素的残基，如瓜氨酸、四氧嘧啶和尿囊素，虽然也会产生一种带颜色的产物，但这些化 合物在血清中浓度很低，故很少引起明显的干扰。另一些其它的化合物在血清中浓度高，但 这些色素的最大吸收峰不同，因此不产生明显干扰。胆红素达 171μmol/L、血红蛋白达 10g/L 均无影响。 实验 80 脲酶－波氏比色法测定血清尿素 【原理】 脲酶水解尿素产生 2 分子氨和 1 分子二氧化碳，氨在碱性介质中与苯酚及次 氯酸钠反应，生成蓝色的吲哚酚阴离子，此过程需用亚硝基铁氰化钠催化反应。蓝色吲哚酚 的生成量与尿素含量成正比，在 630nm 波长处有吸收峰。 【试剂】 1．酚显色剂 苯酚 10g，亚硝基铁氰化钠(含 2 分子水)0.05g，溶于 1L 无氨去离子水中， 存放 4℃可保存 2 个月。 2．碱性次氯酸钠溶液 氢氧化钠 5g 溶于无氨去离子水中，加“安替福明”8ml(相当于次 氯酸钠 0.42g)，再加无氨去离子水至 1L，置棕色瓶内，4℃可保存 2 个月。 3．脲酶贮存液 脲酶(比活性 3 000～4 000U/g)0.2g 置于 20ml 50%(V/V)甘油中，4℃可保 存 6 个月。 4．脲酶应用液 脲酶贮存液 1ml，加 10g/L EDTA-Na2 溶液(pH6.5)至 100ml，4℃保存可 稳定 1 个月。 5．尿素标准液(5.0mmol/L) 见二乙酰一肟法。 【操作步骤】 按表 13-2 操作

表13-2脲酶-波氏比色法操作步骤加入物(ml)测定管标准管空白管脲酶应用液1.01.01.0血福0.01一尿素标准液 0.01 一无氨去离子水0.01混匀，37℃水浴15min酚显色剂5.05.05.0碱性次氯酸钠5.05.05.0混匀，置37℃水浴20min。波长630nm，空白管调零，读取吸光度。【计算】=A测定×5尿素(mmol /L)=A标准【参考范围】同二乙酰一法(实验79)。【注意事项】1.本法亦能测定尿液中尿素，但尿中的氨比血清中的氨多1000多倍，因而测定尿氨时氨必须经过校正，可测定用脲酶处理前尿标本中的氨以校正内源性氨。2．空气中氨气对试剂或玻璃器皿的污染或使用铵盐抗凝剂可使结果偏高。高浓度氟化物可抑制尿素酶，引起结果假性偏低。【评价】1．呈色稳定性在1h内吸光度的波动仅为0.005，12h后较最初吸光度读数也仅增高0.01~0.02。2.本法批内CV<1.8%，批间CV<2.7%；回收率96.71%~103.35%；与酶偶联法对照测定病人标本37例，相关系数(r)为0.972；线性范围较宽，达17.58mmol/L3．大气及试剂用水中的氨可明显干扰尿素的测定，使结果假性增高。酶工作液接触大气8d后，测定值上升1.07mmol/L；去离子水明显吸收氨，使测定值明显升高。胆红素在34.2umol/L以上时尿素测定值有不同程度的降低，在25.65~68.4uμmol/L之间时，平均降低0.47mmol/L，但与胆红素含量不成正比。实验81酶偶联速率法测定血清尿素4

4 表 13-2 脲酶-波氏比色法操作步骤 加入物(ml) 测定管 标准管 空白管 脲酶应用液 1.0 1.0 1.0 血 清 0.01 — — 尿素标准液 — 0.01 — 无氨去离子水 — — 0.01 混匀，37℃水浴 15min 酚显色剂 5.0 5.0 5.0 碱性次氯酸钠 5.0 5.0 5.0 混匀，置 37℃水浴 20min。波长 630nm，空白管调零，读取吸光度。 【计算】 ( / ) =  5 标准 尿素 测定 A A mmol L 【参考范围】 同二乙酰一肟法(实验 79)。 【注意事项】 1．本法亦能测定尿液中尿素，但尿中的氨比血清中的氨多 1 000 多倍，因而测定尿氨时， 氨必须经过校正，可测定用脲酶处理前尿标本中的氨以校正内源性氨。 2．空气中氨气对试剂或玻璃器皿的污染或使用铵盐抗凝剂可使结果偏高。高浓度氟化物 可抑制尿素酶，引起结果假性偏低。 【评价】 1．呈色稳定性 在 1h 内吸光度的波动仅为 0.005，12h 后较最初吸光度读数也仅增高 0.01～0.02。 2．本法批内 CV＜1.8%，批间 CV＜2.7%；回收率 96.71%～103.35%；与酶偶联法对照 测定病人标本 37 例，相关系数(r)为 0.972；线性范围较宽，达 17.58mmol/L。 3．大气及试剂用水中的氨可明显干扰尿素的测定，使结果假性增高。酶工作液接触大气 8d 后，测定值上升 1.07mmol/L；去离子水明显吸收氨，使测定值明显升高。胆红素在 34.2μ mol/L 以上时尿素测定值有不同程度的降低，在 25.65～68.4μmol/L 之间时，平均降低 0.47mmol/L，但与胆红素含量不成正比。 实验 81 酶偶联速率法测定血清尿素

【原理】尿素经脲酶催化水解生成2分子氨及1分子二氧化碳，在谷氨酸脱氢酶催化下，氨与α-酮戊二酸还原型辅酶1作用生成谷氨酸与氧化型辅酶I。还原型辅酶I在340nm波长处有吸收峰，其吸光度下降的速率与待测样品中尿素的含量成正比。其反应式如下：尿素+H,O_尿素蒂→2NH,+CO,NH,+α-酮戊二酸+NADH+H+GLDH>谷氨酸+NAD*+H,0【试剂】1．酶试剂试剂成分和在反应液中的参考浓度如下：pH8.0Tris-琥珀酸缓冲液150mmol/L脲酶8 000U/L700 U/L谷氨酸脱氢酶(GLDH)还原型辅酶I(NADH)0.3mmol/Lα-酮戊二酸15mmol/LADP1.5mmol/L目前较多采用双试剂法，脲酶和NADH单独分装可延长保存期限，各试剂公司采用不同方法，使试剂有效期有所不同。2.尿素标准液(5.0mmol/L）见二乙酰一法(实验79)。【操作步骤】按表13-3操作。表13-3酶偶联速率法操作步骤加入物(ml)空白管标准管测定管血清0.0150.015尿素标准应用液无氨去离子水0.0151.51.5 酶试剂1.5混匀后立即在附有恒温装置的分光光度计上监测吸光度变化(AA/min)。测定参数温度37℃，波长340nm，平衡时间30s，读数时间30s，样品/反应总体积为1101。本法适用于各种类型的自动生化分析仪，测定参数可参照仪器和试剂盒说明书。(二测定M/mmn-空自A/mx5【计算】尿素(mmol/ L)=标准^A/min-空白A/min5

5 【原理】 尿素经脲酶催化水解生成 2 分子氨及 1 分子二氧化碳，在谷氨酸脱氢酶催化 下，氨与α-酮戊二酸还原型辅酶Ⅰ作用生成谷氨酸与氧化型辅酶Ⅰ。还原型辅酶Ⅰ在 340nm 波长处有吸收峰，其吸光度下降的速率与待测样品中尿素的含量成正比。其反应式如下： NH NADH H NAD H O H O 2NH CO 2 GLDH 3 2 3 2 +  − + + ⎯⎯⎯→ + + + ⎯⎯⎯→ + 酮戊二酸 + 谷氨酸 + 尿素 尿素酶 【试剂】 1．酶试剂 试剂成分和在反应液中的参考浓度如下： pH8.0Tris-琥珀酸缓冲液 150mmol/L 脲酶 8 000U/L 谷氨酸脱氢酶(GLDH) 700 U/L 还原型辅酶Ⅰ(NADH) 0.3mmol/L α-酮戊二酸 15mmol/L ADP 1.5mmol/L 目前较多采用双试剂法，脲酶和 NADH 单独分装可延长保存期限，各试剂公司采用不同 方法，使试剂有效期有所不同。 2．尿素标准液(5.0mmol/L) 见二乙酰一肟法(实验 79)。 【操作步骤】 按表 13-3 操作。 表 13-3 酶偶联速率法操作步骤 加入物(ml) 空白管 标准管 测定管 血清 － － 0.015 尿素标准应用液 － 0.015 － 无氨去离子水 0.015 － － 酶试剂 1.5 1.5 1.5 混匀后立即在附有恒温装置的分光光度计上监测吸光度变化(ΔA/min)。 测定参数 温度 37℃，波长 340nm，平衡时间 30s，读数时间 30s，样品/反应总体积为 1∶ 101。本法适用于各种类型的自动生化分析仪，测定参数可参照仪器和试剂盒说明书。 【计算】 5 min min min min ( / )   −   −  = A A A A mmol L 标准 空白 测定 空白 尿素

【参考范围】同二乙酰一法(实验79)。【注意事项】1．在340nm试剂空白对水的吸光度应大于1.00A，试剂浑浊或吸光度低于1.00A的应放弃使用。2．测定过程中，各种器材和去离子水均应无氨离子污染，防止交叉污染，否则结果偏高3.血液标本最好用血清，含NaF的血浆可导致结果偏低。4．在内源性氨正常时，本法能用于测定尿中的尿素。因为在反应的最初几秒种内内源性氨会很快被耗尽，随后在340nm测定的是由脲酶催化尿素反应生成的氨所引起的吸光度。【评价】1.本法批内CV0.78%，批间CV2.94%；回收率93.0%~105.3%，线性上限为17.85mmol/L2．血红蛋白对测定有一定的干扰，应避免标本溶血。在自动分析仪中测定，因标本被大量稀释，故不受其它含氮化合物、胆红素、血红蛋白及高血脂的干扰。第二节血清肌酐测定肌酐的检测目前多用的仍然是碱性苦味酸比色法，手工分析需去除蛋白后再测定，以避免假肌酐干扰；自动化分析则用碱性苦味酸速率法或两点法即能避开假肌酐影响。近几年发展了酶法，如肌酐酰胺水解酶法、肌酐亚氨水解酶法等，但在临床上应用尚少。实验82去蛋白碱性苦味酸法测定血清肌酐【原理】血浆或血清标本经除蛋白处理后，肌酐与碱性苦味酸产生Jaffe反应，生成橙红色的苦味酸肌酐复合物，在510nm和520nm间测定吸光度，与肌酐含量成正比。尿液标本可稀释后直接测定。【试剂】1.35mmol/L钨酸溶液(1)100ml去离子水中，加入1g聚乙烯醇，加热助溶(勿煮沸)，冷却。(2)300ml去离子水中，加入11.1g钨酸钠(Na2WO42H20,Mw329.81)，使完全溶解；(3)300ml去离子水中，慢慢加入2.1ml浓硫酸，冷却。于1L容量瓶中，将(1)液加入(2)液中，再与(3)液混匀，加去离子水至刻度，室温稳定1年。6

6 【参考范围】 同二乙酰一肟法(实验 79)。 【注意事项】 1．在 340nm 试剂空白对水的吸光度应大于 1.00A，试剂浑浊或吸光度低于 1.00A 的应放 弃使用。 2．测定过程中，各种器材和去离子水均应无氨离子污染，防止交叉污染，否则结果偏高。 3．血液标本最好用血清，含 NaF 的血浆可导致结果偏低。 4．在内源性氨正常时，本法能用于测定尿中的尿素。因为在反应的最初几秒种内内源性 氨会很快被耗尽，随后在 340nm 测定的是由脲酶催化尿素反应生成的氨所引起的吸光度。 【评价】 1．本法批内CV 0.78%，批间CV 2.94%；回收率93.0%～105.3%，线性上限为17.85mmol/L。 2．血红蛋白对测定有一定的干扰，应避免标本溶血。在自动分析仪中测定，因标本被大 量稀释，故不受其它含氮化合物、胆红素、血红蛋白及高血脂的干扰。 第二节 血清肌酐测定 肌酐的检测目前多用的仍然是碱性苦味酸比色法，手工分析需去除蛋白后再测定，以避 免假肌酐干扰；自动化分析则用碱性苦味酸速率法或两点法即能避开假肌酐影响。近几年发 展了酶法，如肌酐酰胺水解酶法、肌酐亚氨水解酶法等，但在临床上应用尚少。 实验 82 去蛋白碱性苦味酸法测定血清肌酐 【原理】 血浆或血清标本经除蛋白处理后，肌酐与碱性苦味酸产生 Jaffé反应，生成橙 红色的苦味酸肌酐复合物，在 510nm 和 520nm 间测定吸光度，与肌酐含量成正比。尿液标本 可稀释后直接测定。 【试剂】 1．35mmol/L 钨酸溶液 (1) 100ml 去离子水中，加入 1g 聚乙烯醇，加热助溶(勿煮沸)，冷却。 (2) 300ml 去离子水中，加入 11.1g 钨酸钠(Na2WO4 2H2O,Mw 329.81)，使完全溶解； (3) 300ml 去离子水中，慢慢加入 2.1ml 浓硫酸，冷却。 于 1L 容量瓶中，将(1)液加入(2)液中，再与(3)液混匀，加去离子水至刻度，室温稳定 1 年

2.0.04mol/L苦味酸溶液苦味酸(Mw229.104)9.3g，溶于500ml80℃去离子水中，冷却至室温，加去离子水至IL。用0.1mol/L氢氧化钠滴定，以酚酞作指示剂。根据滴定结果，用去离子水定容至0.04mmol/L。0.04mol/L氢氧化钠1ml相当于0.04mmol/L苦味酸1ml(9.1644mg)。3.0.75mol/L氢氧化钠溶液氢氧化钠30g，加去离子水使其溶解，冷却后用去离子水定容至1L。4.肌酐标准贮存液(10mmol/L）113mg肌酐(Mw113.12)用0.1mol/L盐酸溶解，并移入100ml容量瓶内，再用0.1mo/L盐酸定容至刻度。5.肌酐标准应用液(100μmol/L）取1ml肌酐标准贮存液，用0.1mo/L盐酸稀释至100ml。【操作步骤】1.取血清(或血浆)0.5ml，加入35mmo/L钨酸溶液4.5ml，充分混勺，静置5min,3000r/min离心10min，取上清液；若为尿液标本用去离子水作1:200稀释。2.按表13-4操作。表13-4去蛋白碱性苦味酸法操作步骤加入物(ml)测定管标准管空白管血清无蛋白滤液(或1:200稀释尿液）3.03.0肌酐标准应用液3.0去离子水1.0 苦味酸溶液1.01.01.01.0氢氧化钠溶液1.0混匀后室温15min，波长510nm，空白管调零，读取各管吸光度。【计算】A血清肌酐(μmol /L):×100A标准【参考范围】男性：44~133μmol/L；女性：70~106μmol/L【临床意义】血液肌酐经肾小球过滤，肾小管既不重吸收，也不分泌，即肾脏对肌酐的排泄能力强，因而肾脏疾病早期血浆肌酐通常不高，在反映肾小球滤过率下降方面，血肌酐比血尿素的灵敏度低。但血肌酐受饮食、运动、激素、蛋白质代谢等因素的影响较少，所以诊断特异性比血尿素好。【注意事项】1.据报道碱性肌酐苦味酸复合物的最大吸光度在485nm，过量苦味酸离子存在于反应液

7 2．0.04mol/L 苦味酸溶液 苦味酸(Mw229.104)9.3g，溶于 500ml 80℃去离子水中，冷却 至室温，加去离子水至 1L。用 0.1mol/L 氢氧化钠滴定，以酚酞作指示剂。根据滴定结果，用 去离子水定容至 0.04mmol/L。0.04mol/L 氢氧化钠 1ml 相当于 0.04mmol/L 苦味酸 1ml (9.1644mg)。 3．0.75mol/L 氢氧化钠溶液 氢氧化钠 30g，加去离子水使其溶解，冷却后用去离子水 定容至 1L。 4．肌酐标准贮存液(10mmol/L) 113mg 肌酐(Mw113.12)用 0.1mol/L 盐酸溶解，并移入 100ml 容量瓶内，再用 0.1mol/L 盐酸定容至刻度。 5．肌酐标准应用液(100μmol/L) 取 1ml 肌酐标准贮存液，用 0.1mol/L 盐酸稀释至 100ml。 【操作步骤】 1．取血清(或血浆)0.5ml，加入 35mmol/L 钨酸溶液 4.5ml，充分混匀，静置 5min，3 000r/min 离心 10min，取上清液；若为尿液标本用去离子水作 1∶200 稀释。 2．按表 13-4 操作。 表 13-4 去蛋白碱性苦味酸法操作步骤 加入物(ml) 测定管 标准管 空白管 血清无蛋白滤液(或 1∶200 稀释尿液) 3.0 － － 肌酐标准应用液 － 3.0 － 去离子水 － － 3.0 苦味酸溶液 1.0 1.0 1.0 氢氧化钠溶液 1.0 1.0 1.0 混匀后室温 15min，波长 510nm，空白管调零，读取各管吸光度。 【计算】 100 A A (mol / L) =  标准 血清肌酐 测定 【参考范围】 男性：44～133μmol/L；女性： 70～106μmol/L 【临床意义】 血液肌酐经肾小球过滤，肾小管既不重吸收，也不分泌，即肾脏对肌酐 的排泄能力强，因而肾脏疾病早期血浆肌酐通常不高，在反映肾小球滤过率下降方面，血肌 酐比血尿素的灵敏度低。但血肌酐受饮食、运动、激素、蛋白质代谢等因素的影响较少，所 以诊断特异性比血尿素好。 【注意事项】 1．据报道碱性肌酐苦味酸复合物的最大吸光度在 485nm，过量苦味酸离子存在于反应液

中，在波长低于500nm时会产生明显的吸收。2．反应温度以15～25℃为宜，10℃以下，会抑制Jaffe反应。温度升高，可使碱性苦味酸溶液显色增深，但测定管较标准管更为明显3.呈色后标准管色泽较稳定，但测定管吸光度随时间延长而增加，可能与血标本中存在的非特异性物质有关，故在加显色剂后30min内比色为宜，4.苦味酸一定要纯，否则需纯化。若含有杂质，则使试剂空白吸光度增加而影响测定结果。【评价】1.特异性血浆中的蛋白质和糖、丙酮、维生素C、丙酮酸、乙酰乙酸等均能与碱性苦味酸发生非特异性反应，反应速率稍慢。红细胞中这类物质最多，约有60%，血浆或血清约20%，尿液约5%。故血清和血浆需制备无蛋白滤液后测定。2.回收率受无蛋白滤液的pH影响，滤液pH在3~4.5时，回收率为85%～90%，pH在2以下时，回收率为100%。3.线性范围肌酐含量在1320umoL/L以内线性良好。实验83不去蛋白速率法测定血清肌酐【原理】根据肌酐与苦味酸反应生成桔红色苦味酸肌酐复合物的速度与假肌酐不同，而设置适宜的检测时间。一些假肌酐如乙酰乙酸在20s内已与碱性苦味酸反应，而在20~80s之间，肌酐反应占绝对优势，80s后其它多数干扰物才有较快的反应，故而选择25～60s的反应速率来反映真肌酐的含量。【试剂】1.0.04mol/L苦味酸溶液。2.0.32mol/L氢氧化钠溶液。3.碱性苦味酸溶液根据用量，将0.04mol/L苦味酸和0.32mol/L氢氧化钠等体积混合可加适量表面活性剂如 TritonX-100，放置20min以后即可应用。4.肌酐标准液同除蛋白碱性苦味酸法。【操作步骤】采用自动/半自动分析仪速率法检测，按试剂盒说明书操作，或参照以下参数分析：仪器波长510nm，比色杯光径1.0cm，反应温度37℃，样品/反应体积=1/11。延迟时间20~30s，测量时间30s。得到标准管AA/min和测定管AA/min。d

8 中，在波长低于 500nm 时会产生明显的吸收。 2．反应温度以 15～25℃为宜，10℃以下，会抑制 Jaffe 反应。温度升高，可使碱性苦味 酸溶液显色增深，但测定管较标准管更为明显。 3．呈色后标准管色泽较稳定，但测定管吸光度随时间延长而增加，可能与血标本中存在 的非特异性物质有关，故在加显色剂后 30min 内比色为宜。 4．苦味酸一定要纯，否则需纯化。若含有杂质，则使试剂空白吸光度增加而影响测定结 果。 【评价】 1．特异性 血浆中的蛋白质和糖、丙酮、维生素 C、丙酮酸、乙酰乙酸等均能与碱性苦 味酸发生非特异性反应，反应速率稍慢。红细胞中这类物质最多，约有 60%，血浆或血清约 20%，尿液约 5%。故血清和血浆需制备无蛋白滤液后测定。 2．回收率 受无蛋白滤液的 pH 影响，滤液 pH 在 3～4.5 时，回收率为 85%～90%，pH 在 2 以下时，回收率为 100%。 3．线性范围 肌酐含量在 1 320μmoL/L 以内线性良好。 实验 83 不去蛋白速率法测定血清肌酐 【原理】 根据肌酐与苦味酸反应生成桔红色苦味酸肌酐复合物的速度与假肌酐不同， 而设置适宜的检测时间。一些假肌酐如乙酰乙酸在 20s 内已与碱性苦味酸反应，而在 20～80s 之间，肌酐反应占绝对优势，80s 后其它多数干扰物才有较快的反应，故而选择 25～60s 的反 应速率来反映真肌酐的含量。 【试剂】 1．0.04mol/L 苦味酸溶液。 2．0.32mol/L 氢氧化钠溶液。 3．碱性苦味酸溶液 根据用量，将 0.04mol/L 苦味酸和 0.32mol/L 氢氧化钠等体积混合， 可加适量表面活性剂如 Triton X-100，放置 20min 以后即可应用。 4．肌酐标准液同除蛋白碱性苦味酸法。 【操作步骤】 采用自动/半自动分析仪速率法检测，按试剂盒说明书操作，或参照以下 参数分析：仪器波长 510nm，比色杯光径 1.0cm，反应温度 37℃，样品/反应体积＝1/11。延 迟时间 20～30s，测量时间 30s。得到标准管 ΔA/min 和测定管 ΔA/min

_测定 MA/mlx×100【计算】血清肌酐(μmo / L=标准A/m【参考范围】男性：53~97umol/L：女性：44~80umol/L【注意事项】1．必须严格控制反应时间，以尽量避免快速或慢速反应假肌酐物质的干扰。2．溶血产生的红细胞内非特异性物质将干扰反应。3．胆红素可引起负偏差。某些全自动生化分析仪，能设置空白速率参数，能去除胆红素负干扰。【评价】1．特异性本法基本上可消除生理浓度的葡萄糖、维生素 C和蛋白质等的干扰。但乙酰乙酸>500umol/L、维生素C>2840umol/L、丙酮酸>1140umol/L时有明显的干扰。高胆红素标本有明显的负干扰，溶血标本也有负干扰，标本应避免溶血。2.回收试验96.7%~100.4%，平均98.5%。3．线性范围肌酐在1768umol/L范围内，线性良好。实验84内生肌酐清除率测定【原理】通过测定血和尿中肌酐含量来计算每分钟或24h有多少毫升或升血浆中的肌酐通过肾脏被清除，此值称为内生肌酐清除率。肌酐清除率与个体的大小有关，可用体表面积来校正。【操作步骤】试验前3天，嘱受检者禁食肉类，避免饮用咖啡或茶，停用利尿剂，避免剧烈运动。适量饮水，使尿量不少于1ml/min。收集24h尿样的同时，抽静脉血3ml。同时测定血、尿肌酐含量。【计算】尿中肌酐(mol/)×24h 尿量(L)内生肌酐清除率(L/24h)=血中肌(μmol / L)内生因的,) -2 1.73校正后内生肌酐清除率(ml/min)=内生肌酐清除率×体表面积(m2)体表面积可根据人体体表面积计算图查阅，见图13-1。9

9 【计算】 100 min min ( / )    = A A mol L 标准 测定 血清肌酐  【参考范围】 男性：53～97μmol/L；女性：44～80μmol/L 【注意事项】 1．必须严格控制反应时间，以尽量避免快速或慢速反应假肌酐物质的干扰。 2．溶血产生的红细胞内非特异性物质将干扰反应。 3．胆红素可引起负偏差。某些全自动生化分析仪，能设置空白速率参数，能去除胆红素 负干扰。 【评价】 1．特异性 本法基本上可消除生理浓度的葡萄糖、维生素 C 和蛋白质等的干扰。但乙 酰乙酸＞500μmol/L、维生素 C＞2840μmol/L、丙酮酸＞1 140μmol/L 时有明显的干扰。高 胆红素标本有明显的负干扰，溶血标本也有负干扰，标本应避免溶血。 2．回收试验 96.7%～100.4%，平均 98.5%。 3．线性范围 肌酐在 1 768μmol/L 范围内，线性良好。 实验 84 内生肌酐清除率测定 【原理】 通过测定血和尿中肌酐含量来计算每分钟或 24h 有多少毫升或升血浆中的肌 酐通过肾脏被清除，此值称为内生肌酐清除率。肌酐清除率与个体的大小有关，可用体表面 积来校正。 【操作步骤】 试验前 3 天，嘱受检者禁食肉类，避免饮用咖啡或茶，停用利尿剂，避 免剧烈运动。适量饮水，使尿量不少于 1ml/min。收集 24h 尿样的同时，抽静脉血 3ml。同时 测定血、尿肌酐含量。 【计算】 内生肌酐清除率(L/24h) = ( / ) ( / ) mol L mol L   血中肌酐 尿中肌酐 ×24h 尿量(L) 内生肌酐清除率(ml/min) = L/24h× 1440 1000 校正后内生肌酐清除率(ml/min) = 内生肌酐清除率× ( ) 1.73 2 体表面积 m 体表面积可根据人体体表面积计算图查阅，见图 13-1

图13-1人体体表面积计算图图13-1人体体表面积计算图【参考范围】男：105±20ml/min女：95±20m/min【临床意义】血浆肌酐浓度(Sc)反映肾小球滤过功能，与肾小球滤过率(GRF)共同用于慢性肾功能不全的分期：第一期（肾功能不全代偿期)：Scr133~177umol/L；GRF50~80ml/min。第二期（肾功能不全失代偿期)：Scr178~442μmol/L：GRF50~20ml/min。第三期（肾功能衰竭期)：Scr443～707umol/L；GRF20~10ml/min第四期（尿毒症期)：Scr≥707umol/L；GRF<10ml/min。【注意事项】1．最常见误差来源是尿液收集时间记录不准，或部分尿液丢失，因此要准确收集尿液。要避免尿液在膀胱内潴留造成负误差，即要排空膀胱。2.收集尿液期间避免作剧烈运动。3．不同体表面积对结果影响很大，每个个体都应查图得出此值。第三节血清尿酸测定尿酸测定方法可分为尿酸酶紫外法、尿酸酶一过氧化物酶偶联法及磷钨酸法三类。其中以尿酸酶紫外法的分析性能最为优越，是尿酸测定的参考方法。磷钨酸法先用血清或血浆制备无蛋白滤液再进行测定，方法繁琐，需手工测定，现在临床已较少应用。自动化分析可用尿酸酶一过氧化物酶偶联法，无需做无蛋白滤液实验85磷钨酸还原法测定血清尿酸【原理】去蛋白滤液中的尿酸在碱性溶液中被磷钨酸氧化生成尿囊素和二氧化碳，磷钨酸被还原为蓝色的钨蓝。钨蓝的生成量与尿酸浓度成正比。【试剂】10

10 图 13-1 人体体表面积计算图 图 13-1 人体体表面积计算图 【参考范围】 男：105±20ml/min 女：95±20 ml/min 【临床意义】 血浆肌酐浓度(SCr)反映肾小球滤过功能，与肾小球滤过率(GRF)共同用于慢性肾功能不全 的分期： 第一期 (肾功能不全代偿期)：SCr 133～177μmol/L；GRF 50～80ml/min。 第二期 (肾功能不全失代偿期)：SCr 178～442μmol/L；GRF 50～20ml/min。 第三期 (肾功能衰竭期)：SCr 443～707μmol/L；GRF 20～10ml/min。 第四期 (尿毒症期)：SCr≥707μmol/L；GRF＜10ml/min。 【注意事项】 1．最常见误差来源是尿液收集时间记录不准，或部分尿液丢失，因此要准确收集尿液。 要避免尿液在膀胱内潴留造成负误差，即要排空膀胱。 2．收集尿液期间避免作剧烈运动。 3．不同体表面积对结果影响很大，每个个体都应查图得出此值。 第三节 血清尿酸测定 尿酸测定方法可分为尿酸酶紫外法、尿酸酶－过氧化物酶偶联法及磷钨酸法三类。其 中以尿酸酶紫外法的分析性能最为优越，是尿酸测定的参考方法。磷钨酸法先用血清或血 浆制备无蛋白滤液再进行测定，方法繁琐，需手工测定，现在临床已较少应用。自动化分 析可用尿酸酶－过氧化物酶偶联法，无需做无蛋白滤液。 实验 85 磷钨酸还原法测定血清尿酸 【原理】 去蛋白滤液中的尿酸在碱性溶液中被磷钨酸氧化生成尿囊素和二氧化碳，磷 钨酸被还原为蓝色的钨蓝。钨蓝的生成量与尿酸浓度成正比。 【试剂】