《临床生物化学》课程教学资源（实验指导）第2章 层析技术

第二章层析技术实验5离子交换柱层析法分离混合氨基酸【原理】聚乙烯强酸型阳离子交换树脂常用于分离氨基酸，它含有带负电荷的磺酸基团，能够与带正电荷的阳离子发生可逆的离子交换反应。当混合氨基酸样品溶液为酸性时氨基酸主要以阳离子形式存在，上柱后与树脂上的钠离子发生交换而与树脂“结合”，由于各种氨基酸等电点不同，与树脂的亲和力不同，因此，可选择适当pH和离子强度的缓冲液将它们依次洗脱，酸性较大的氨基酸先被洗脱下来，接着是中性氨基酸，最后是碱性氨基酸。本实验是分离混合样品中的谷氨酸(pl=3.22)、苯丙氨酸(pl=5.48)及赖氨酸(pl=9.74)使用pH5.28的柠檬酸缓冲溶液为洗脱液。pH5.28时，谷氨酸带负电荷，不与树脂结合，首先被洗脱出来；赖氨酸带正电荷，与树脂结合较紧，洗脱最慢；苯丙氨酸带正电荷较弱，与树脂的结合力介于前二者之间，所以在前二者之中洗脱出来。洗脱液中氨基酚与三酮一TiCI3液反应显色，通过比色定量。【试剂】1.树脂Zerolit225型(相当于国产强酸732型树脂)阳离子交换树脂，浮选流速为480ml/min。2.洗脱液pH5.28柠檬酸缓冲液。柠檬酸(C.O7Hs·H20）28.5gNaOH 18.6gHC(12mol/L)10.5ml用蒸馏水定容到1000ml。3.样品液精确称取谷氨酸14.70mg，苯丙氨酸16.50mg，赖氨酸14.60mg，溶于0.2mol/LHC110.0ml中，充分溶解，混匀后各成分氨基酸的浓度为5mmol/L，冰箱保存。4.60%乙醇溶液。5.显色液1%节三酮-TiCls溶液。(1）称取无水醋酸钠48.9g及柠檬酸0.6g，溶于蒸馏水11ml中，再加冰醋酸19ml，然后用蒸馏水定容至150ml，用柠檬酸钠调pH至5.5。(2）称取三酮10g，溶于乙二醇350ml中，加三氯化钛3.7ml，通N2混匀，存冰箱中。【操作步骤】1.树脂的处理对于市售干树脂，先经水充分溶胀后，经浮选得到颗粒大小适合的树脂

第二章 层析技术 实验 5 离子交换柱层析法分离混合氨基酸 【原理】 聚乙烯强酸型阳离子交换树脂常用于分离氨基酸，它含有带负电荷的磺酸基 团，能够与带正电荷的阳离子发生可逆的离子交换反应。当混合氨基酸样品溶液为酸性时， 氨基酸主要以阳离子形式存在，上柱后与树脂上的钠离子发生交换而与树脂“结合”，由于各 种氨基酸等电点不同，与树脂的亲和力不同，因此，可选择适当 pH 和离子强度的缓冲液将 它们依次洗脱，酸性较大的氨基酸先被洗脱下来，接着是中性氨基酸，最后是碱性氨基酸。 本实验是分离混合样品中的谷氨酸(pI＝3.22)、苯丙氨酸(pI＝5.48)及赖氨酸(pI＝9.74)， 使用 pH5.28 的柠檬酸缓冲溶液为洗脱液。pH 5.28 时，谷氨酸带负电荷，不与树脂结合，首 先被洗脱出来；赖氨酸带正电荷，与树脂结合较紧，洗脱最慢；苯丙氨酸带正电荷较弱，与 树脂的结合力介于前二者之间，所以在前二者之中洗脱出来。洗脱液中氨基酚与茚三酮—TiCl3 液反应显色，通过比色定量。 【试剂】 1．树脂 Zerolit 225 型(相当于国产强酸 732 型树脂)阳离子交换树脂，浮选流速为 480 ml/min。 2．洗脱液 pH 5.28 柠檬酸缓冲液。 柠檬酸(C6O7H8·H2O) 28.5g NaOH 18.6g HCl(12mol/L) 10.5ml 用蒸馏水定容到 1 000ml。 3．样品液 精确称取谷氨酸 14.70mg，苯丙氨酸 16.50mg，赖氨酸 14.60mg，溶于 0.2mol/L HCl 10.0ml 中，充分溶解，混匀后各成分氨基酸的浓度为 5mmol/L，冰箱保存。 4．60%乙醇溶液。 5．显色液 1%茚三酮-TiCl3 溶液。 (1) 称取无水醋酸钠 48.9g 及柠檬酸 0.6g，溶于蒸馏水 11 ml 中，再加冰醋酸 19ml，然后 用蒸馏水定容至 150ml，用柠檬酸钠调 pH 至 5.5。 (2) 称取茚三酮 10g，溶于乙二醇 350ml 中，加三氯化钛 3.7ml，通 N2 混匀，存冰箱中。 【操作步骤】 1．树脂的处理 对于市售干树脂，先经水充分溶胀后，经浮选得到颗粒大小适合的树脂

然后加3倍量的2mol/LHCI溶液，在水浴中不断搅拌加热到80℃，30min后自水浴中取出倾去酸液，用蒸馏水洗至中性，然后用2mol/LNaOH溶液，同上洗树脂30min后，用蒸馏水洗至中性，这样用酸碱反复轮洗，直到溶液无黄色为止。以1mol/LNaOH溶液转树脂为钠型，蒸馏水洗至中性备用。过剩的树脂浸入Imol/LNaOH溶液中保存，以防细菌生长。2.装柱取玻璃层析柱(20cm×0.6cm）一支，垂直装好，用夹子夹紧柱底出口处橡皮管在柱内加入2～3cm高的柠檬酸缓冲液。将搅拌成悬浮状的树脂沿柱内壁缓慢倒入，防止气泡产生。待树脂在柱底部逐渐沉积2～3cm高时，用吸管吸去柱内上层清波，慢慢打开柱底出口，继续加入树脂悬液，直至树脂高度达到16～18cm为止3．平衡层析柱装好后，再缓慢沿管壁加满缓冲液，接上恒流泵(或恒压瓶)，用柠檬酸缓冲液以5滴/min的流速平衡40min左右，直至流出液的pH与缓冲液的pH相等为止。4．加样加样前，收集1.5ml平衡液作测定空白管。移去层析柱上连接泵的橡胶管，用滴管吸去上层缓冲液，打开柱底出口，小心使柱内液面流下恰好至树脂表面时，立即关闭出口(注意：不要使液面下降至树脂表面下)。用加样器吸取氨基酸混合样品20ul，沿靠近树脂表面的管壁慢慢加入，以免冲坏树脂表面。5.洗脱加样后缓慢地打开柱底管夹，使液面尽可能缓慢地流下至与树脂表面恰好平齐，马上关闭柱底出口，然后再用滴管吸取适量洗脱液清洗柱内壁2~3次(每次用量约0.5ml)小心加缓冲液离柱顶部1cm为止，然后接上连接恒流泵的橡皮管，以5滴/min开始洗脱。6.收集层析柱洗脱液用自动部分收集器按每10min收集1管（约1.5ml)，收集13~16管。亦可用刻度试管进行手工收集。7.测定将收集的洗脱液各管编好号后，于每管内加入三酮显色液0.5ml，摇匀后在100℃水浴上加热15min，然后冷却到40℃左右，加入60%乙醇1.5ml定容之，摇匀后于1h内在570nm处比色。以平衡液为空白管，记录各管吸光度读数。以吸光度为纵坐标，收集的管数或体积为横坐标，绘制出洗脱曲线。【注意事项】1.在柠檬酸缓冲液中加入0.1%酚溶液可防止长霉。在室温较高的夏季，配制缓冲液用的蒸馏水必须是新鲜蒸馏水，配前煮沸，配好后在4℃保存。2.在装柱时避免使柱内液体流干而使装柱失败。装好的层析柱应均匀，没有气泡、节痕和界面，树脂顶面平整，否则要重装柱。3．调节流速前要排除恒流泵与柱间连接管内所有气泡，以免影响流速。4.样品体积不要过大。样品的含量不能超过层析柱内离子交换能力，否则影响分离效果。5．样品要集中和均匀分布，并不被柱上缓冲液定容。因此，应先将离子交换剂顶上的缓

然后加 3 倍量的 2mol/L HCl 溶液，在水浴中不断搅拌加热到 80℃，30min 后自水浴中取出， 倾去酸液，用蒸馏水洗至中性，然后用 2mol/L NaOH 溶液，同上洗树脂 30min 后，用蒸馏水 洗至中性，这样用酸碱反复轮洗，直到溶液无黄色为止。以 1 mol/L NaOH 溶液转树脂为钠型， 蒸馏水洗至中性备用。过剩的树脂浸入 1mol/L NaOH 溶液中保存，以防细菌生长。 2．装柱 取玻璃层析柱(20cm×0.6cm)一支，垂直装好，用夹子夹紧柱底出口处橡皮管， 在柱内加入 2～3cm 高的柠檬酸缓冲液。将搅拌成悬浮状的树脂沿柱内壁缓慢倒入，防止气 泡产生。待树脂在柱底部逐渐沉积 2～3cm 高时，用吸管吸去柱内上层清波，慢慢打开柱底 出口，继续加入树脂悬液，直至树脂高度达到 16～18cm 为止。 3．平衡 层析柱装好后，再缓慢沿管壁加满缓冲液，接上恒流泵(或恒压瓶)，用柠檬酸 缓冲液以 5 滴/min 的流速平衡 40min 左右，直至流出液的 pH 与缓冲液的 pH 相等为止。 4．加样 加样前，收集 1.5ml 平衡液作测定空白管。移去层析柱上连接泵的橡胶管，用 滴管吸去上层缓冲液，打开柱底出口，小心使柱内液面流下恰好至树脂表面时，立即关闭出 口(注意：不要使液面下降至树脂表面下)。用加样器吸取氨基酸混合样品 20μl，沿靠近树脂 表面的管壁慢慢加入，以免冲坏树脂表面。 5．洗脱 加样后缓慢地打开柱底管夹，使液面尽可能缓慢地流下至与树脂表面恰好平齐， 马上关闭柱底出口，然后再用滴管吸取适量洗脱液清洗柱内壁 2～3 次(每次用量约 0.5ml)， 小心加缓冲液离柱顶部 1cm 为止，然后接上连接恒流泵的橡皮管，以 5 滴/min 开始洗脱。 6．收集 层析柱洗脱液用自动部分收集器按每 10min 收集 1 管(约 1.5ml)，收集 13～16 管。亦可用刻度试管进行手工收集。 7．测定 将收集的洗脱液各管编好号后，于每管内加入茚三酮显色液 0.5ml，摇匀后在 100℃水浴上加热 15min，然后冷却到 40℃左右，加入 60%乙醇 1.5ml 定容之，摇匀后于 1h 内在 570nm 处比色。以平衡液为空白管，记录各管吸光度读数。以吸光度为纵坐标，收集的 管数或体积为横坐标，绘制出洗脱曲线。 【注意事项】 1．在柠檬酸缓冲液中加入 0.1%酚溶液可防止长霉。在室温较高的夏季，配制缓冲液用 的蒸馏水必须是新鲜蒸馏水，配前煮沸，配好后在 4℃保存。 2．在装柱时避免使柱内液体流干而使装柱失败。装好的层析柱应均匀，没有气泡、节痕 和界面，树脂顶面平整，否则要重装柱。． 3．调节流速前要排除恒流泵与柱间连接管内所有气泡，以免影响流速。 4．样品体积不要过大。样品的含量不能超过层析柱内离子交换能力，否则影响分离效果。 5．样品要集中和均匀分布，并不被柱上缓冲液定容。因此，应先将离子交换剂顶上的缓

冲液放出(但不能让空气进入交换剂内)，再将样品均匀地滴到交换剂面上。为避免破坏柱床面，可沿管壁四周慢慢加入，再用少量缓冲液洗柱内壁，实验6凝胶过滤法分离蛋白质【原理】在含有血红蛋白(Mw=64500)加入过量的高铁氰化钾(K:Fe(CN)，Mw=327.25)，血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白(methemoglobin，MetHb)。为了除去多余的高铁氰化钾，得到较纯的MetHb样品，将上述混合物通过交联葡聚糖凝胶柱，用磷酸缓冲液洗脱，从颜色的不同，可直接观察到MetHb(红褐色)洗脱较快，而小分子高铁氰化钾(黄色)洗脱较慢，达到将MetHb完全分离出来的目的。【试剂】1.抗凝全血。2. 四氯化碳(CCI4)。3.生理盐水。4.交联葡聚糖G-25(细粒)。5.0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)。6. 0.4% K3Fe(CN)6 。【操作】1.凝胶准备称取5g交联葡聚糖G-25，倾入锥形瓶中，加蒸馏水约60ml溶胀，搅动后静置。待凝胶沉积后，用倾注法除去浮于表面的细粒，重复3次。将溶胀后的凝胶用10倍体积的磷酸缓冲液浸泡过夜，以达平衡。2．装柱取玻璃层析柱(25cmX×1.5cm）一支，垂直装好。加入缓冲液，打开出口，将气泡赶出，关闭出口。然后从管顶向柱内加入缓冲液8cm左右高，将平衡后的交联葡聚糖G-25悬浮液边搅拌边加入柱内，再打开出口，使液体流出，继续不断地加入交联葡聚糖G-25悬浮液，柱内凝胶柱床沉积至高20cm左右时为止。床面上覆盖3ml缓冲液，关闭出口，在凝胶柱面上加盖一层圆形滤纸，使层析柱稳定5～10min后，接储液瓶，打开出口，用2倍于床体积的磷酸缓冲液洗脱平衡，最后关闭出口。3.样品处理(1）血红蛋白溶液的制备：取草酸盐抗凝全血3ml离心，吸去上层血浆，加入5倍体积的冷生理盐水，混匀后3000r/min离心5min，弃去上清液，重复洗3次。最后一次吸去上清液后，在红细胞层上面加等体积蒸馏水，振摇。再加1/2体积CCl4，用力振摇3min，3000r/min

冲液放出(但不能让空气进入交换剂内)，再将样品均匀地滴到交换剂面上。为避免破坏柱床 面，可沿管壁四周慢慢加入，再用少量缓冲液洗柱内壁。 实验 6 凝胶过滤法分离蛋白质 【原理】 在含有血红蛋白(Mw＝64 500)加入过量的高铁氰化钾(K3Fe(CN)6，Mw＝ 327.25)，血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白(methemoglobin，MetHb)。为了除去 多余的高铁氰化钾，得到较纯的 MetHb 样品，将上述混合物通过交联葡聚糖凝胶柱，用磷酸 缓冲液洗脱，从颜色的不同，可直接观察到 MetHb(红褐色)洗脱较快，而小分子高铁氰化钾(黄 色)洗脱较慢，达到将 MetHb 完全分离出来的目的。 【试剂】 1．抗凝全血。 2．四氯化碳(CCl4)。 3．生理盐水。 4．交联葡聚糖 G-25(细粒)。 5．0.1mol/L 磷酸缓冲液(pH7.0)。 6．0.4% K3Fe(CN)6 。 【操作】 1．凝胶准备 称取 5g 交联葡聚糖 G-25，倾入锥形瓶中，加蒸馏水约 60ml 溶胀，搅动 后静置。待凝胶沉积后，用倾注法除去浮于表面的细粒，重复 3 次。将溶胀后的凝胶用 10 倍 体积的磷酸缓冲液浸泡过夜，以达平衡。 2．装柱 取玻璃层析柱(25cm×1.5cm)一支，垂直装好。加入缓冲液，打开出口，将气 泡赶出，关闭出口。然后从管顶向柱内加入缓冲液 8cm 左右高，将平衡后的交联葡聚糖 G-25 悬浮液边搅拌边加入柱内，再打开出口，使液体流出，继续不断地加入交联葡聚糖 G-25 悬浮 液，柱内凝胶柱床沉积至高 20cm 左右时为止。床面上覆盖 3ml 缓冲液，关闭出口，在凝胶 柱面上加盖一层圆形滤纸，使层析柱稳定 5～10min 后，接储液瓶，打开出口，用 2 倍于床体 积的磷酸缓冲液洗脱平衡，最后关闭出口。 3．样品处理 (1) 血红蛋白溶液的制备：取草酸盐抗凝全血 3ml 离心，吸去上层血浆，加入 5 倍体积 的冷生理盐水，混匀后 3 000r/min 离心 5min，弃去上清液，重复洗 3 次。最后一次吸去上清 液后，在红细胞层上面加等体积蒸馏水，振摇。再加 1/2 体积 CCl4，用力振摇 3min，3 000r/min

离心5min。吸取上层澄清的血红蛋白液备用。此溶液中Hb浓度约为10%(置4℃暂存，一周用完)。(2）样品：血红蛋白液3滴加K3Fe(CN)8滴和蒸馏水2滴混合，制成MetHb混合样品4．上样、洗脱打开平衡好的层析柱出口，使柱内溶液流出至刚露出柱床面时即关闭出口。吸混合物样品0.5ml左右，在距离床面1mm处沿管内壁轻轻转动加进样品，切勿搅动床面。然后打开出口，使样品进入床内，直至床面重新露出。同上加入1～2倍样品量体积的洗脱液(这样可以使样品定容至最小，而样品又完全进入床内)，当少量洗脱液将流入床面时加入多量的洗脱液，但注意切勿搅动床面凝胶，连接储液瓶进行洗脱。5．分部收集用自动部分收集器，以5滴/min，5min/管的速度进行收集。并且观察柱上的色带，待黄色的K3Fe(CN)色带完全洗脱下来后，再继续收集两管透明的洗脱液作为空白，关闭出口。6.测定将每管收集液加入缓冲液至4ml，混匀，在425nm处测其吸光度，以吸光度为纵坐标，管数为横坐标，绘出洗脱图谱。【注意事项】1．装柱后要检查柱床是否均匀，若有气泡或分层的界面时，需要重新装柱。2．流速不可太快，否则分子小的物质来不及扩散，随分子大的物质一起被洗脱下来，达不到分离目的。实验7亲和层析法提取特异性IgG【原理】在一定条件下，抗原与抗体能可逆地结合成复合物，当条件改变（如稀酸、稀碱、浓盐、加温等)时，抗原抗体复合物又可能解离。如果将抗原或抗体固定在不溶性的载体上，就能从液相中专一性地分出抗体或抗原。根据这一原理，将可溶性抗原用化学方法偶联到固相载体上，抗血清中相应的抗体就与抗原特异性结合，其他蛋白成分随洗脱液流出。然后改变缓冲液的pH值和离子强度，可以使抗体和偶联在载体上的抗原解离，经洗脱得到纯化的抗体。【试剂】1.琼脂糖(Sepharose)4B。2. 2mol/LNaOH溶液。3.溴化氰。4. 0.15mol/L PBS(pH7.2)

离心 5min。吸取上层澄清的血红蛋白液备用。此溶液中 Hb 浓度约为 10%(置 4℃暂存，一周 用完)。 (2) 样品：血红蛋白液 3 滴加 K3Fe(CN)6 8 滴和蒸馏水 2 滴混合，制成 MetHb 混合样品。 4．上样、洗脱 打开平衡好的层析柱出口，使柱内溶液流出至刚露出柱床面时即关闭出 口。吸混合物样品 0.5ml 左右，在距离床面 1mm 处沿管内壁轻轻转动加进样品，切勿搅动床 面。然后打开出口，使样品进入床内，直至床面重新露出。同上加入 1～2 倍样品量体积的洗 脱液(这样可以使样品定容至最小，而样品又完全进入床内)，当少量洗脱液将流入床面时， 加入多量的洗脱液，但注意切勿搅动床面凝胶，连接储液瓶进行洗脱。 5．分部收集 用自动部分收集器，以 5 滴/min，5min/管的速度进行收集。并且观察柱 上的色带，待黄色的 K3Fe(CN)6 色带完全洗脱下来后，再继续收集两管透明的洗脱液作为空 白，关闭出口。 6．测定 将每管收集液加入缓冲液至 4ml，混匀，在 425nm 处测其吸光度，以吸光度为 纵坐标，管数为横坐标，绘出洗脱图谱。 【注意事项】 1．装柱后要检查柱床是否均匀，若有气泡或分层的界面时，需要重新装柱。 2．流速不可太快，否则分子小的物质来不及扩散，随分子大的物质一起被洗脱下来，达 不到分离目的。 实验 7 亲和层析法提取特异性 IgG 【原理】 在一定条件下，抗原与抗体能可逆地结合成复合物，当条件改变(如稀酸、稀 碱、浓盐、加温等)时，抗原抗体复合物又可能解离。如果将抗原或抗体固定在不溶性的载体 上，就能从液相中专一性地分出抗体或抗原。根据这一原理，将可溶性抗原用化学方法偶联 到固相载体上，抗血清中相应的抗体就与抗原特异性结合，其他蛋白成分随洗脱液流出。然 后改变缓冲液的 pH 值和离子强度，可以使抗体和偶联在载体上的抗原解离，经洗脱得到纯 化的抗体。 【试剂】 1．琼脂糖(Sepharose)4B。 2．2mol/L NaOH 溶液。 3．溴化氰。 4．0.15mol/L PBS(pH7.2)

5.0.1mol/L硼酸一硼砂缓冲溶液(pH8.3）精确称取硼砂9.54g、硼酸6.18g、氯化钠4.38g加蒸馏水溶解至1000ml6.10%FeCl:溶液。7.0.15mol/LNaCI 溶液。8.3mol/L硫氰酸钾用10mmol/LPBS(pH6.1)配制9.人IgG溶液用硼酸-硼砂缓冲液定容至10~20mg/ml。10.免抗人IgG溶液分别经50%和40%饱和度的硫酸铵沉淀1次，并用0.15mol/LPBS(pH7.2)平衡。【操作】1.活化载体(1）取Sepharose4B28ml置于100ml的烧杯中，用蒸馏水洗涤3次。洗涤方法是将凝胶悬于水中，然后静置2~3h，倾去上液再换新的蒸馏水。(2）在布氏漏斗上铺好滤纸，将Sepharose4B倾于滤纸上，减压抽滤，尽量除去水分后，加入蒸馏水20ml。(3)称固体溴化氰1g，置带塞的三角烧瓶中，加入蒸馏水20ml，配成5%浓度，在电磁搅拌器上使充分溶解(约20min)。(4）将Sepharose4B置电磁搅拌器上，用2mol/LNaOH溶液调节pH至11.0～11.5，然后加入5%溴化氰溶液20ml，2min内加完，不时加入2mol/LNaOH溶液，使pH保持在11.0~11.5范围。(5)10min后立即倒入布氏漏斗，分别用冷蒸馏水200ml及冷硼酸一硼砂缓冲液抽滤洗涤(最好在90s内完成)。2.偶联(）取IgG以硼酸一硼砂缓冲液定容为10~20mg/ml，总量为20ml（一般偶联量为10~30mg/g载体)。(2）将上述已活化的Sepharose4B迅速加入其中，放在旋转盘上以10r/min缓慢搅拌，在4℃维持18～20h，使其充分偶联。(3）加入0.15mol/LPBS(pH7.2)20ml，用布氏漏斗抽滤，收集滤液。从滤液中蛋白质含量可求得Sepharose4B偶联蛋白质量。(4）继续用大量0.15mol/LPBS(pH7.2)洗涤，以除去未结合的残余蛋白质，再加入0.15mo/LPBS(pH7.2)混匀。3.装柱柱型可根据需要选用。一般为1.5cm×15cm的层析柱可装偶联的Sepharose4B

5．0.1mol/L 硼酸—硼砂缓冲溶液(pH8.3) 精确称取硼砂 9.54g、硼酸 6.18g、氯化钠 4.38g， 加蒸馏水溶解至 1 000ml。 6．10%FeCl3 溶液。 7．0.15mol/L NaCl 溶液。 8．3 mol/L 硫氰酸钾 用 10mmol/L PBS (pH6.1)配制。 9．人 IgG 溶液 用硼酸-硼砂缓冲液定容至 10～20mg/ml。 10．兔抗人 IgG 溶液 分别经 50%和 40%饱和度的硫酸铵沉淀 1 次，并用 0.15mol/L PBS (pH7.2)平衡。 【操作】 1．活化载体 (1) 取 Sepharose4B 28ml 置于 100ml 的烧杯中，用蒸馏水洗涤 3 次。洗涤方法是将凝胶 悬于水中，然后静置 2～3h，倾去上液再换新的蒸馏水。 (2) 在布氏漏斗上铺好滤纸，将 Sepharose4B 倾于滤纸上，减压抽滤，尽量除去水分后， 加入蒸馏水 20ml。 (3 )称固体溴化氰 1g，置带塞的三角烧瓶中，加入蒸馏水 20ml，配成 5%浓度，在电磁搅 拌器上使充分溶解(约 20min)。 (4) 将 Sepharose4B 置电磁搅拌器上，用 2mol/L NaOH 溶液调节 pH 至 11.0～11.5，然后 加入 5%溴化氰溶液 20ml，2min 内加完，不时加入 2mol/L NaOH 溶液，使 pH 保持在 11.0～ 11.5 范围。 (5) 10min 后立即倒入布氏漏斗，分别用冷蒸馏水 200ml 及冷硼酸－硼砂缓冲液抽滤洗涤 (最好在 90s 内完成)。 2．偶联 (1) 取 IgG 以硼酸－硼砂缓冲液定容为 10～20mg/ml，总量为 20ml(一般偶联量为 10～ 30mg/g 载体)。 (2) 将上述已活化的 Sepharose4B 迅速加入其中，放在旋转盘上以 10r/min 缓慢搅拌，在 4℃维持 18～20h，使其充分偶联。 (3) 加入 0.15mol/L PBS(pH7.2) 20ml，用布氏漏斗抽滤，收集滤液。从滤液中蛋白质含量 可求得 Sepharose4B 偶联蛋白质量。 (4) 继续用大量 0.15mol/L PBS(pH7.2)洗涤，以除去未结合的残余蛋白质，再加入 0.15mol/L PBS (pH7.2)混匀。 3．装柱 柱型可根据需要选用。一般为 1.5cm×15cm 的层析柱可装偶联的 Sepharose4B

约30ml。以3mol/L硫氰酸钾洗涤，流速为0.5ml/min。A280 接近0(吸光度为0.02以后，可除去非特异性吸附的蛋白质及结合不牢的蛋白质)，再以0.15mol/LPBS(pH7.2)平衡，流出液pH与上柱的缓冲液pH相同。4.上样取免抗人IgG溶液多次少量上柱，样品浓度为2%，按柱床体积的1/10加样。5.洗脱、收集(1）当样品进入柱后，用0.15mol/LPBS(pH7.2)洗脱，流速为10ml/h，至A280接近零。(2）用3mol/L硫氰酸钾解离，此时流速可以增快至0.5ml/min。6.透析收集洗脱液装入透析袋，以0.15mol/LNaCI溶液透析至无硫氰酸钾，即取透析液2ml加入10%FeCls溶液1~2滴，阳性为橘黄色至深红色。7.鉴定浓缩蛋白液至10～20mg/ml。可用聚丙烯酰胺凝胶电泳，或者用羊抗兔血清做双向琼脂扩散试验，或者免疫电泳进行纯度鉴定。亦可用免抗人IgG检查有否脱落的IgG。【注意事项】1.溴化氰(CNBr)为透明无色晶体，熔点52℃，沸点61～62℃，室温下强烈挥发，有剧毒。必须在有良好排气装置的通风橱内操作，工作室内空气也要流通。含CNBr的废液可加入固体次氯酸钙或次氯酸钠，用力搅动使完全溶化，达到中和目的。皮肤少量污染CNBr时立即用流水冲洗，大量污染时可用次氯酸钙或次氯酸钠溶液清洗。不能用肥皂洗，因会促使CNBr吸收。2．活化时一般主张在冰浴中进行。有人发现4℃活化者较24℃活化者结合率可提高35%~40%。3.柱的再生用0.15mol/LPBS(pH7.2)反复洗涤至A280<0.02，此时表示无硫氰酸钾。4.载体活化剂溴化氰的加入量一般按Sepharose4B5～10ml加入溴化氰1～3g5.CNBr活化Sepharose4B时pH必须保持在11左右，这对于Sepharose4B的活化程度有决定性意义。由于活化过程中不断释放 Ht，使 pH下降，因此需不断加入NaOH以保持 pH稳定。实验8固相层析免疫分析法快速检测肌钙蛋白I肌钙蛋白I(troponinI,CTn-L)是肌钙蛋白-原肌球蛋白调节复合物中的抑制蛋白，它增强钙离子对横纹肌动蛋白ATP酶的活性的敏感性，由此调节横纹肌动和肌球蛋白的相互作用！在快收缩和慢收缩骨骼肌纤维和心肌纤维中存在着不同的肌钙蛋白I异构体，分子量为24kDa的肌钙蛋白I只存在于心肌

约 30ml。以 3mol/L 硫氰酸钾洗涤，流速为 0.5ml/min。A280 接近 0(吸光度为 0.02 以后，可除 去非特异性吸附的蛋白质及结合不牢的蛋白质)，再以 0.15mol/L PBS (pH7.2)平衡，流出液 pH 与上柱的缓冲液 pH 相同。 4．上样 取兔抗人 IgG 溶液多次少量上柱，样品浓度为 2%，按柱床体积的 1/10 加样。 5．洗脱、收集 (1) 当样品进入柱后，用 0.15mol/L PBS (pH7.2)洗脱，流速为 10ml/h，至 A280 接近零。 (2) 用 3mol/L 硫氰酸钾解离，此时流速可以增快至 0.5ml/min。 6．透析 收集洗脱液装入透析袋，以 0.15mol/L NaCl 溶液透析至无硫氰酸钾，即取透析 液 2ml 加入 10%FeCl3 溶液 1～2 滴，阳性为橘黄色至深红色。 7．鉴定 浓缩蛋白液至 10～20mg/ml。可用聚丙烯酰胺凝胶电泳，或者用羊抗兔血清做 双向琼脂扩散试验，或者免疫电泳进行纯度鉴定。亦可用兔抗人 IgG 检查有否脱落的 IgG。 【注意事项】 1．溴化氰(CNBr)为透明无色晶体，熔点 52℃，沸点 61～62℃，室温下强烈挥发，有剧 毒。必须在有良好排气装置的通风橱内操作，工作室内空气也要流通。含 CNBr 的废液可加 入固体次氯酸钙或次氯酸钠，用力搅动使完全溶化，达到中和目的。皮肤少量污染 CNBr 时 立即用流水冲洗，大量污染时可用次氯酸钙或次氯酸钠溶液清洗。不能用肥皂洗，因会促使 CNBr 吸收。 2．活化时一般主张在冰浴中进行。有人发现 4℃活化者较 24℃活化者结合率可提高 35%～40%。 3．柱的再生用 0.15mol/L PBS( pH7.2)反复洗涤至 A280＜0.02，此时表示无硫氰酸钾。 4．载体活化剂溴化氰的加入量一般按 Sepharose4B 5～10ml 加入溴化氰 1～3g。 5．CNBr 活化 Sepharose4B 时 pH 必须保持在 11 左右，这对于 Sepharose4B 的活化程度 有决定性意义。由于活化过程中不断释放 H+，使 pH 下降，因此需不断加入 NaOH 以保持 pH 稳定。 实验 8 固相层析免疫分析法快速检测肌钙蛋白Ⅰ 肌钙蛋白Ⅰ(troponin Ⅰ, CTn-Ⅰ)是肌钙蛋白-原肌球蛋白调节复合物中的抑制蛋白，它增 强钙离子对横纹肌动蛋白 ATP 酶的活性的敏感性，由此调节横纹肌动和肌球蛋白的相互作用， 在快收缩和慢收缩骨骼肌纤维和心肌纤维中存在着不同的肌钙蛋白Ⅰ异构体，分子量为 24kDa 的肌钙蛋白Ⅰ只存在于心肌

【原理】本法采用固相层析免疫分析技术定性检测人血标本中的肌钙蛋白1。首先将血标本加到样品孔中，其中的肌钙蛋白I即与抗体-染料结合物结合，移动至测定区。由于测定区中含固化抗体，抗原-抗体染料复合物与固化的抗体相结合，未结合的染料复合物移出测定区外，其中有一些在对照区被捕获。如标本中的肌钙蛋白1的含量大于设定的临界值，即在测定区和对照区出现肉眼可见的紫红色水平带，表示结果阳性；如果只在对照区出现色带，表示结果阴性，即肌钙蛋白1的含量小于临界值；若对照区也无色带出现，不管测定区有无色带，结果无效，需重新测定。本实验只能报告定性结果，帮助心肌梗塞的快速诊断。若需取得可靠的定量结果，则建议作定量分析。【试剂】肌钙蛋白试剂盒：包被有兔抗肌钙蛋白I多克隆抗体膜条，浸渗有抗肌钙蛋白1单抗的染料垫，以及用于调整抗原抗体在蛋白基质上活性的过滤垫。每个试剂盒封装在干燥袋中。【操作步骤】1.标本本试验可采用全血、血清或血浆标本。2.技术操作(1）用微量加样器加130u1全血、血清或血浆标本于样品孔中(SamplewellS)。(2)15min后读取结果。加样后30min内结果保持稳定。【结果解释】15min测定区和对照区中的颜色强度可能会加深，阳性结果即使在几天后膜干燥了也不会改变。但是，若显示窗中膜干燥，背景的颜色会出现，影响阳性结果的判断，1.阳性出现两条色带，一条在测定区(testarea，T)。另一条在对照区(control area,C),表示结果阳性。注意：一旦在测定区出现紫红色色带，就可读取结果。强阳性标本的阳性测定结果在10min内就可出现。强阳性标本在测定区的色带比对照带先出现，测定带比对照带深。弱阳性标本在测定区的色带比对照带后出现，测定带比对照带浅。2．阴性对照区(C)中出现色带，测定区(T)中除了正常的背景颜色外无明显色带出现，表示标本中的肌钙蛋白1的含量低于设定的临界值。若对照区在15min内无色带出现，实验无效，应重新测定。3.无效【参考范围】文献资料对181名健康供血者用本试剂测得正常值的上限为0.2ng/ml。本品设计阳性结果为肌钙蛋白含量>0.2ng/ml。【临床意义】心肌钙蛋白I已用于在急诊室对胸痛的鉴别诊断，它的释放形式与CK-MB相似，但心肌

【原理】 本法采用固相层析免疫分析技术定性检测人血标本中的肌钙蛋白Ⅰ。首先将 血标本加到样品孔中，其中的肌钙蛋白Ⅰ即与抗体-染料结合物结合，移动至测定区。由于测 定区中含固化抗体，抗原-抗体染料复合物与固化的抗体相结合，未结合的染料复合物移出测 定区外，其中有一些在对照区被捕获。 如标本中的肌钙蛋白Ⅰ的含量大于设定的临界值，即在测定区和对照区出现肉眼可见的 紫红色水平带，表示结果阳性；如果只在对照区出现色带，表示结果阴性，即肌钙蛋白Ⅰ的 含量小于临界值；若对照区也无色带出现，不管测定区有无色带，结果无效，需重新测定。 本实验只能报告定性结果，帮助心肌梗塞的快速诊断。若需取得可靠的定量结果，则建 议作定量分析。 【试剂】 肌钙蛋白Ⅰ试剂盒：包被有兔抗肌钙蛋白Ⅰ多克隆抗体膜条，浸渗有抗肌钙 蛋白Ⅰ单抗的染料垫，以及用于调整抗原抗体在蛋白基质上活性的过滤垫。每个试剂盒封装 在干燥袋中。 【操作步骤】 1．标本 本试验可采用全血、血清或血浆标本。 2．技术操作 (1) 用微量加样器加 130μl 全血、血清或血浆标本于样品孔中(Sample well S)。 (2) 15min 后读取结果。加样后 30min 内结果保持稳定。 【结果解释】 15min 测定区和对照区中的颜色强度可能会加深，阳性结果即使在几天后 膜干燥了也不会改变。但是，若显示窗中膜干燥，背景的颜色会出现，影响阳性结果的判断。 1．阳性 出现两条色带，一条在测定区(test area，T)。另一条在对照区(control area, C)， 表示结果阳性。注意：一旦在测定区出现紫红色色带，就可读取结果。 强阳性标本的阳性测定结果在 10min 内就可出现。 强阳性标本在测定区的色带比对照带先出现，测定带比对照带深。 弱阳性标本在测定区的色带比对照带后出现，测定带比对照带浅。 2．阴性 对照区(C)中出现色带，测定区(T)中除了正常的背景颜色外无明显色带出现， 表示标本中的肌钙蛋白Ⅰ的含量低于设定的临界值。 3．无效 若对照区在 15min 内无色带出现，实验无效，应重新测定。 【参考范围】 文献资料对 181 名健康供血者用本试剂测得正常值的上限为 0.2ng/ml。本 品设计阳性结果为肌钙蛋白Ⅰ含量＞0.2ng/ml。 【临床意义】 心肌钙蛋白Ⅰ已用于在急诊室对胸痛的鉴别诊断，它的释放形式与 CK-MB 相似，但心肌

钙蛋白水平升高持续时间较长，心肌钙蛋白1水平在正常健康人中水平很低，在骨骼肌损伤患者也测不到。它能鉴别骨骼肌蛋白血清水平增高的周围性的急性心肌梗塞。因此，用心肌钙蛋白I来诊断急性心肌梗塞是最完美的。般在症状出现后3~10h血中含量达到正常值上限，10~24h到最大值。某些病人其含量升高可保持6～10d。因此，症状开始出现的前几h测定结果为阴性并不能排除急性心肌梗塞的可能。若怀疑为心肌梗塞，在适当间隔时间后重复测定，肌钙蛋白1水平的测定可辅助诊断：手术后并发症、创伤后、肾功能衰竭病人、骨骼肌损伤和癫痫发作等病人的急性心肌梗塞。附：全自动化学发光测定血浆肌钙蛋白1含量全自动化学发光仪检测方法，为实现全自动免疫分析的应用发挥了很大作用。现将化学发光免疫分析(Chemiluminescent immunoassay，CLIA)检测肌钙蛋白1介绍如下。1.全自动化学发光免疫定量分析仪原理与操作程序系统，参照操作手册2．.试剂与全自动仪配套专用，条码识别批号、效期和监视试剂量3.样本准备EDTA抗凝血(或不抗凝血)3ml，离心分离血浆(或血清)，取0.5ml血浆放入上机专用试管，上机待测。4。试剂按程序系统编入或扫描进人仪器测试系统。5.编制测试程序(参随机编样程序步骤)6。启动在视窗监视下，观察提示和运行轨道项目状态。通常情况20min打出第一个样本报告，每隔20s打出另一样本报告

钙蛋白水平升高持续时间较长，心肌钙蛋白Ⅰ水平在正常健康人中水平很低，在骨骼肌损伤 患者也测不到。它能鉴别骨骼肌蛋白血清水平增高的周围性的急性心肌梗塞。因此，用心肌 钙蛋白Ⅰ来诊断急性心肌梗塞是最完美的。 一般在症状出现后 3～10h 血中含量达到正常值上限，10～24h 到最大值。某些病人其含 量升高可保持 6～10d。因此，症状开始出现的前几 h 测定结果为阴性并不能排除急性心肌梗 塞的可能。若怀疑为心肌梗塞，在适当间隔时间后重复测定。 肌钙蛋白Ⅰ水平的测定可辅助诊断：手术后并发症、创伤后、肾功能衰竭病人、骨骼肌 损伤和癫痫发作等病人的急性心肌梗塞。 附：全自动化学发光测定血浆肌钙蛋白Ⅰ含量 全自动化学发光仪检测方法，为实现全自动免疫分析的应用发挥了很大作用。现将化学发光免疫分析 (Chemiluminescent immunoassay，CLIA)检测肌钙蛋白Ⅰ介绍如下。 1．全自动化学发光免疫定量分析仪 原理与操作程序系统，参照操作手册。 2．试剂 与全自动仪配套专用，条码识别批号、效期和监视试剂量。 3．样本准备 EDTA 抗凝血(或不抗凝血)3ml，离心分离血浆(或血清)，取 0.5ml 血浆放入上机专用试 管，上机待测。 4．试剂 按程序系统编入或扫描进人仪器测试系统。 5．编制 测试程序(参随机编样程序步骤)。 6．启动 在视窗监视下，观察提示和运行轨道项目状态。通常情况 20min 打出第一个样本报告，每 隔 20s 打出另一样本报告