《临床生物化学》课程教学资源（实验指导）第7章 血清（浆）蛋白质测定

第七章血清(浆)蛋白质测定实验34双缩脲法测定血清总蛋白【原理】血清(浆)中蛋白质的肽键(-CO-NH-)在碱性溶液中能与 2 价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物。此反应和两个尿素分子缩合后生成的双缩脲(H2N-OC-NH-CO-NH2)在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，故称之为双缩脲反应。这种紫红色络合物在540nm处有明显吸收峰，吸光度在一定范围内与血清蛋白含量呈正比关系，经与同样处理的蛋白质标准液比较，即可求得蛋白质含量。【试剂与器材】可购商品试剂或自配。1.6mol/LNaOH溶液称取NaOH240g，溶于新鲜制备的蒸馏水(或刚煮沸冷却的去离子水)约800ml中，冷却后定容至1L，贮于有盖塑料瓶中。若用非新开瓶的NaOH，须先配成饱和溶液，静置2周左右，使碳酸盐沉淀，其上清饱和NaOH溶液经滴定后，算出准确浓度再使用。2.双缩脲试剂称取硫酸铜结晶（CuSO45H2O)3g溶于新鲜制备的蒸馏水（或刚煮沸冷却的去离子水)500ml中，加入酒石酸钾钠(NaKC4H4O·4H2O，用以结合Cu2+，防止 CuO在碱性条件下沉淀)9g 和KI(防止碱性酒石酸铜自动还原并防止Cu20的离析)5g，待完全溶解后，在搅拌下加入6mol/LNaOH溶液100ml，并用蒸馏水定容至1L，置塑料瓶中盖紧保存。此试剂室温下可稳定半年，若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。3.双缩脲空白试剂除不含硫酸铜外，其余成分与双缩脲试剂相同。4.60~70g/L蛋白质标准液常用牛血清白蛋白或收集混合血清(无黄疽、无溶血、乙型肝炎表面抗原阴性、肝肾功能正常的人血清)，经凯氏定氮法定值，亦可用定值参考血清或标准白蛋白作标准。但定值质控血清定值准确性较差，不能

1 第七章 血清(浆)蛋白质测定 实验 34 双缩脲法测定血清总蛋白 【原理】 血清(浆)中蛋白质的肽键(-CO-NH-)在碱性溶液中能与 2 价铜离子 作用生成稳定的紫红色络合物。此反应和两个尿素分子缩合后生成的双缩脲 (H2N-OC-NH-CO-NH2)在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，故称 之为双缩脲反应。这种紫红色络合物在 540nm 处有明显吸收峰，吸光度在一定范 围内与血清蛋白含量呈正比关系，经与同样处理的蛋白质标准液比较，即可求得 蛋白质含量。 【试剂与器材】 可购商品试剂或自配。 1．6 mol/L NaOH 溶液 称取 NaOH 240g，溶于新鲜制备的蒸馏水(或刚煮沸 冷却的去离子水)约 800ml 中，冷却后定容至 1 L，贮于有盖塑料瓶中。若用非新 开瓶的 NaOH，须先配成饱和溶液，静置 2 周左右，使碳酸盐沉淀，其上清饱和 NaOH 溶液经滴定后，算出准确浓度再使用。 2．双缩脲试剂 称取硫酸铜结晶(CuSO4·5H2O) 3g 溶于新鲜制备的蒸馏水(或 刚煮沸冷却的去离子水)500ml 中，加入酒石酸钾钠(NaKC4H4O6·4H2O，用以结合 Cu2+，防止 CuO 在碱性条件下沉淀)9g 和 KI(防止碱性酒石酸铜自动还原并防止 Cu2O 的离析)5g，待完全溶解后，在搅拌下加入 6mol/L NaOH 溶液 100ml，并用 蒸馏水定容至 1L，置塑料瓶中盖紧保存。此试剂室温下可稳定半年，若贮存瓶中 有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 3．双缩脲空白试剂 除不含硫酸铜外，其余成分与双缩脲试剂相同。 4．60～70g/L 蛋白质标准液 常用牛血清白蛋白或收集混合血清(无黄疸、无 溶血、乙型肝炎表面抗原阴性、肝肾功能正常的人血清)，经凯氏定氮法定值，亦 可用定值参考血清或标准白蛋白作标准。但定值质控血清定值准确性较差，不能

用作血清总蛋白测定的标准物。5.仪器自动生化分析仪或分光光度计。【操作步骤】1.生化自动分析仪法按试剂盒说明书提供的参数进行操作。2.手工操作法（1）手工操作参数：波长540nm，光径1cm；温度：室温（18~26℃）；模式终点法；反应时间：30min，样本量：100ul，试剂量：5ml。(2)操作：取试管4支，标明测定管(U)、标准管(S)、标本空白管(B)、试剂空白管(RB)，按表7-1 操作。表7-1双缩脲法测定血清总蛋白操作步骤加入物(ml)BRBsU血清0.10-一0.10--蛋白标准液0.10-蒸馏水0.10-双缩脲空白试剂5.0--5.0 5.05.0双缩脲试剂/混匀，置25℃30min或37℃10min，在波长540nm处比色，用蒸馏水调零，测各管吸光度。【计算】4.-4e-4×蛋白标准液浓度(g/L)血清总蛋白(g / L)A,-ARB-AB【参考范围】正常成人参考范围为60～80g/L。长久卧床者约低3～5g/L，60岁以上约低2g/L，新生儿总蛋白浓度较低，随后逐月缓慢上升，大约1年后达成人水平。参见表7-2。2

2 用作血清总蛋白测定的标准物。 5．仪器 自动生化分析仪或分光光度计。 【操作步骤】 1．生化自动分析仪法 按试剂盒说明书提供的参数进行操作。 2．手工操作法 (1) 手工操作参数：波长 540nm，光径 1cm；温度：室温(18~26℃)；模式： 终点法；反应时间：30min，样本量：100μl，试剂量：5ml。 (2) 操作：取试管 4 支，标明测定管(U)、标准管(S)、标本空白管(B)、试剂空 白管(RB)，按表 7-1 操作。 表 7-1 双缩脲法测定血清总蛋白操作步骤 加入物(ml) B RB S U 血清 0.10 － － 0.10 蛋白标准液 － － 0.10 － 蒸馏水 － 0.10 － － 双缩脲空白试剂 5.0 － － － 双缩脲试剂 － 5.0 5.0 5.0 混匀，置 25℃30min 或 37℃10min，在波长 540nm 处比色，用蒸馏水调零， 测各管吸光度。 【计算】 ( / ) (g / L) A A A A A A g L s RB B 血清总蛋白 u RB B 蛋白标准液浓度 − − − − 【参考范围】 正常成人参考范围为 60～80g/L。长久卧床者约低 3～5g/L， 60 岁以上约低 2g/L，新生儿总蛋白浓度较低，随后逐月缓慢上升，大约 1 年后达 成人水平。参见表 7-2

表7-2血清TP与年龄和体位的关系早产儿>3岁60~80g/L36~60 g/L新生儿成人46~70g/L非卧床1周龄44~76g/L64~83g/L卧床60~78g/L7月龄～1岁51~73g/L1~2 岁56~75 g/L【临床意义】1.血清总蛋白浓度降低(1）蛋白质合成障碍：当肝功能严重受损时，蛋白质合成减少，以白蛋白降低最为显著。(2）蛋白质丢失增加：严重烧伤，大量血浆渗出；大出血；肾病综合征尿中长期丢失蛋白质；溃疡性结肠炎可从粪便中长期丢失一定量的蛋白质。(3）营养不良或消耗增加：营养失调、低蛋白饮食、维生素缺乏症或慢性肠道疾病所引起的吸收不良使体内缺乏合成蛋白质的原料；长期患消耗性疾病，如严重结核病、恶性肿瘤和甲状腺功能亢进等，均可导致血清总蛋白浓度降低。(4）血浆稀释：如静脉注射过多低渗溶液或各种原因引起的水钠潴留2.血清总蛋白浓度增高（1）蛋白质合成增加：大多见于多发性骨髓瘤患者，此时主要是异常球蛋白增加，使血清总蛋白增加。(2）血浆浓缩：如急性脱水(如呕吐、腹泻、高烧等)，外伤性休克(毛细血管通透性增大)，慢性肾上腺皮质功能减退(尿排钠增多引起继发性失水)。【注意事项】1.黄疽血清、严重溶血；葡萄糖、酚酞及溴磺酰钠对本法有明显干扰，故用标本空白管来消除。但如标本空白管吸光度太高，可影响测定的准确度

3 表 7-2 血清 TP 与年龄和体位的关系 早产儿 36～60 g/L ≥3 岁 60～80g/L 新生儿 46～70g/L 成人 1 周龄 44～76g/L 非卧床 64～83g/L 7 月龄～1 岁 51～73g/L 卧床 60～78g/L 1～2 岁 56～75 g/L 【临床意义】 1．血清总蛋白浓度降低 (1) 蛋白质合成障碍：当肝功能严重受损时，蛋白质合成减少，以白蛋白降低 最为显著。 (2) 蛋白质丢失增加：严重烧伤，大量血浆渗出；大出血；肾病综合征尿中长 期丢失蛋白质；溃疡性结肠炎可从粪便中长期丢失一定量的蛋白质。 (3) 营养不良或消耗增加：营养失调、低蛋白饮食、维生素缺乏症或慢性肠道 疾病所引起的吸收不良使体内缺乏合成蛋白质的原料；长期患消耗性疾病，如严 重结核病、恶性肿瘤和甲状腺功能亢进等，均可导致血清总蛋白浓度降低。 (4) 血浆稀释：如静脉注射过多低渗溶液或各种原因引起的水钠潴留。 2．血清总蛋白浓度增高 (1) 蛋白质合成增加：大多见于多发性骨髓瘤患者，此时主要是异常球蛋白增 加，使血清总蛋白增加。 (2) 血浆浓缩：如急性脱水(如呕吐、腹泻、高烧等)，外伤性休克(毛细血管通 透性增大)，慢性肾上腺皮质功能减退(尿排钠增多引起继发性失水)。 【注意事项】 1．黄疸血清、严重溶血；葡萄糖、酚酞及溴磺酞钠对本法有明显干扰，故用 标本空白管来消除。但如标本空白管吸光度太高，可影响测定的准确度

2.高脂血症混浊血清会干扰比色，可采用下述方法消除：取2支带塞试管或离心管，各加待测血清0.1ml，再加蒸馏水0.5ml和丙酮10ml，塞紧并颠倒混匀10次后离心，倾去上清液，将试管倒立于滤纸上吸去残余液体。向沉淀中分别加入双缩脲试剂及双缩脲空白试剂，再进行与上述相同的其他操作和计算。3.本法也可用于血清总蛋白浓度的标化，测定的操作步骤完全与测定标本时相同，但显色温度须控制在(25土1)℃的范围内，以及使用经过校正的高级分光光度计(波长带宽≤2nm，比色杯光径为准确1.0cm)进行比色。然后再按下式计算标化结果：血清总蛋白(g/L)4-Am-4,510.10.298式中0.298为蛋白质双缩脲络合物的比吸光系数。即按Doumas双缩脲试剂的标准配方，在上述规定的测定条件下，双缩脲反应液中蛋白质浓度为1.0g/L时的吸光度。【评价】1.双缩脲显色反应仅和蛋白质中肽键数成正比关系，与蛋白质的种类、分子量及氨基酸的组成无明显关系，各种蛋白质的显色程度基本相同。2.本法重复性好，RCV为4%，CCV为3.9%；线性范围为0~140g/L；本法干扰少，并且大多可以避免；使用单一的稳定试剂，操作简便、快速，既适于手工操作，也便于自动化分析，已被推荐为测定血清总蛋白的参考方法。3.唯一的缺点是灵敏度较低，比酚试剂法低约100倍。但本法的检出限为0.2~1.7g/L，这相当于70g/L的血清3～24u1，已能满足临床生化检验的需要。4．本法是临床测定血清总蛋白质首选最方便、最实用的常规方法。5．临床上常见的血清蛋白定量法主要有双缩脲法、临床折射计法、染料结合法、BCA法和免疫比浊法

4 2．高脂血症混浊血清会干扰比色，可采用下述方法消除：取 2 支带塞试管或 离心管，各加待测血清 0.1ml，再加蒸馏水 0.5ml 和丙酮 10ml，塞紧并颠倒混匀 10 次后离心，倾去上清液，将试管倒立于滤纸上吸去残余液体。向沉淀中分别加 入双缩脲试剂及双缩脲空白试剂，再进行与上述相同的其他操作和计算。 3．本法也可用于血清总蛋白浓度的标化，测定的操作步骤完全与测定标本时 相同，但显色温度须控制在(25±1)℃的范围内，以及使用经过校正的高级分光光 度计(波长带宽≤2nm，比色杯光径为准确 1.0cm)进行比色。然后再按下式计算标 化结果： 0.1 5.1 0.298 ( / )  Au − ARB − AB 血清总蛋白 g L 式中 0.298 为蛋白质双缩脲络合物的比吸光系数。即按 Doumas 双缩脲试剂的 标准配方，在上述规定的测定条件下，双缩脲反应液中蛋白质浓度为 1.0g/L 时的 吸光度。 【评价】 1．双缩脲显色反应仅和蛋白质中肽键数成正比关系，与蛋白质的种类、分子 量及氨基酸的组成无明显关系，各种蛋白质的显色程度基本相同。 2．本法重复性好，RCV 为 4%，CCV 为 3.9%；线性范围为 0～140g/L；本法 干扰少，并且大多可以避免；使用单一的稳定试剂，操作简便、快速，既适于手 工操作，也便于自动化分析，已被推荐为测定血清总蛋白的参考方法。 3．唯一的缺点是灵敏度较低，比酚试剂法低约 100 倍。但本法的检出限为 0.2～ 1.7g/L，这相当于 70g/L 的血清 3～24μl，已能满足临床生化检验的需要。 4．本法是临床测定血清总蛋白质首选最方便、最实用的常规方法。 5．临床上常见的血清蛋白定量法主要有双缩脲法、临床折射计法、染料结合 法、BCA 法和免疫比浊法

实验35溴甲酚绿法测定血清白蛋白【原理】血清白蛋白在pH4.2的缓冲液中带正电荷，在有非离子型表面活性剂存在时，可与带负电荷的染料溴甲酚绿(bromocresolgreen，BCG)结合形成蓝绿色复合物，在波长630nm处有吸收峰，其颜色深浅与白蛋白浓度成正比例，与同样处理的白蛋白标准比较，可求得血清中白蛋白含量。【试剂与器材】可购商品试剂或自配。1.0.5mol/L琥珀酸缓冲贮存液(pH4.0）称取NaOH10g和琥珀酸56g，溶于蒸馏水800ml中，用1mol/LNaOH溶液调至pH4.1土0.05后，加蒸馏水定容至1L。置4℃冰箱保存。2.10mmol/LBCG贮存液称取BCG(MW=720.02)1.80g溶于1mol/LNaOH溶液5ml中，加蒸馏水至250ml。3.叠氮钠贮存液称取叠氮钠4.0g溶于蒸馏水中，配成100ml。4.聚氧化乙烯月桂醚(Brij-35)贮存液称取Briji-3525g溶于蒸馏水约80ml中，加温助溶，冷却后加蒸馏水至100ml。室温可稳定一年。5.BCG试剂在1L容量瓶内加蒸馏水约400ml，琥珀酸缓冲贮存液100ml用吸管准确加入BCG贮存液8.0ml，并用蒸馏水冲洗吸管壁上残留的染料，加叠氮钠贮存液2.5ml、Brij-35贮存液2.5ml，最后加蒸馏水至刻度，混匀。此溶液pH应为4.15土0.05，盛于加塞的聚乙烯瓶内。在室温保存可稳定半年。6.60g/L白蛋白标准液称取人血清白蛋白6g、叠氮钠50mg，溶于蒸馏水中并缓慢搅拌助溶，配成100ml。密封贮存于4℃冰箱，可稳定半年。也可用定值参考血清白蛋白标准。7．仪器自动生化分析仪或分光光度计。【操作步骤】1．生化自动分析仪分析法各参数见有关仪器操作说明书

5 实验 35 溴甲酚绿法测定血清白蛋白 【原理】 血清白蛋白在 pH4.2 的缓冲液中带正电荷，在有非离子型表面活 性剂存在时，可与带负电荷的染料溴甲酚绿(bromocresol green，BCG)结合形成蓝 绿色复合物，在波长 630nm 处有吸收峰，其颜色深浅与白蛋白浓度成正比例，与 同样处理的白蛋白标准比较，可求得血清中白蛋白含量。 【试剂与器材】 可购商品试剂或自配。 1．0.5mol/L 琥珀酸缓冲贮存液(pH4.0) 称取 NaOH 10g 和琥珀酸 56g，溶于 蒸馏水 800ml 中，用 1mol/L NaOH 溶液调至 pH4.1±0.05 后，加蒸馏水定容至 1L。 置 4℃冰箱保存。 2．10mmol/L BCG 贮存液 称取 BCG(MW＝720.02)1.80g 溶于 1mol/L NaOH 溶液 5ml 中，加蒸馏水至 250ml。 3．叠氮钠贮存液 称取叠氮钠 4.0g 溶于蒸馏水中，配成 100ml。 4．聚氧化乙烯月桂醚(Brij-35)贮存液 称取 Brij-35 25g 溶于蒸馏水约 80ml中， 加温助溶，冷却后加蒸馏水至 100ml。室温可稳定一年。 5．BCG 试剂 在 1L 容量瓶内加蒸馏水约 400ml，琥珀酸缓冲贮存液 100ml， 用吸管准确加入 BCG 贮存液 8.0ml，并用蒸馏水冲洗吸管壁上残留的染料，加叠 氮钠贮存液 2.5ml、Brij-35 贮存液 2.5ml，最后加蒸馏水至刻度，混匀。此溶液 pH 应为 4.15±0.05，盛于加塞的聚乙烯瓶内。在室温保存可稳定半年。 6．60g/L 白蛋白标准液 称取人血清白蛋白 6g、叠氮钠 50mg，溶于蒸馏水中 并缓慢搅拌助溶，配成 100ml。密封贮存于 4℃冰箱，可稳定半年。也可用定值参 考血清白蛋白标准。 7．仪器 自动生化分析仪或分光光度计。 【操作步骤】 1．生化自动分析仪分析法 各参数见有关仪器操作说明书

2.手工操作法(1）手工操作参数：波长630nm，光径1cm；温度：室温；模式：终点法；反应时间：30秒；样品量：0.02ml；试剂量：4ml。(2）操作：取试管3支，按表7-3操作。表7-3BCG法测定白蛋白操作步骤加入物(ml)空白管标准管测定管血清0.02一一0.02白蛋白标准液0.02蒸馏水4.04.04.0BCG试剂在波长630nm处用空白管调零，用定量加液器加BCG试剂，与测定管血清混合后，立即在30±3s内，读取吸光度。如标本因严重高脂血症而混浊，需加做标本空白管(取血清0.02ml，加入琥珀酸缓冲贮存液4.0ml)，用琥珀酸缓冲贮存液调零，测定标本空白管吸光度。用测定管吸光度减去标本空白管吸光度后，再计算结果。【计算】测定管吸光度、血清白蛋白(g/ L)×白蛋白标准液浓度(g/L)标准管吸光度同时用双缩脲法测定血清标本中总蛋白浓度，减去血清白蛋白浓度即为球蛋白浓度，并可求得血清白蛋白、球蛋白比值(A/G比值)。【参考范围】正常成人35~55g/L。【临床意义】1.血清白蛋白浓度增高常见于严重脱水所致的血浆浓缩。2.血清白蛋白浓度降低在临床上比较重要和常见，通常与总蛋白降低的原

6 2．手工操作法 (1) 手工操作参数：波长 630nm，光径 1cm；温度：室温；模式：终点法；反 应时间：30 秒；样品量：0.02ml；试剂量：4ml 。 (2) 操作：取试管 3 支，按表 7-3 操作。 表 7-3 BCG 法测定白蛋白操作步骤 加入物(ml) 空白管 标准管 测定管 血清 － － 0.02 白蛋白标准液 － 0.02 － 蒸馏水 0.02 － － BCG 试剂 4.0 4.0 4.0 在波长 630nm 处用空白管调零，用定量加液器加 BCG 试剂，与测定管血清 混合后，立即在 30±3s 内，读取吸光度。 如标本因严重高脂血症而混浊，需加做标本空白管(取血清 0.02ml，加入琥珀 酸缓冲贮存液 4.0ml)，用琥珀酸缓冲贮存液调零，测定标本空白管吸光度。用测 定管吸光度减去标本空白管吸光度后，再计算结果。 【计算】 (g / L) 白蛋白标准液浓度(g / L) 标准管吸光度 测定管吸光度 血清白蛋白  同时用双缩脲法测定血清标本中总蛋白浓度，减去血清白蛋白浓度即为球蛋 白浓度，并可求得血清白蛋白、球蛋白比值(A/G 比值)。 【参考范围】 正常成人 35～55g/L。 【临床意义】 1．血清白蛋白浓度增高 常见于严重脱水所致的血浆浓缩。 2．血清白蛋白浓度降低 在临床上比较重要和常见，通常与总蛋白降低的原

因大致相同。急性降低主要见于大出血和严重烧伤：慢性降低见于肾病蛋白尿肝功能受损、肠道肿瘤及结核病伴慢性出血、营养不良和恶性肿瘤等。血清白蛋白低于20g/L，临床上出现水肿。3.A/G比值某些病人可同时出现白蛋白减少和球蛋白升高的现象，严重者A/G比值<1.0，这种情况称为A/G比值倒置。4.文献报导还有极少见的因白蛋白合成障碍，血清中几乎没有白蛋白的先天性白蛋白缺乏症。【注意事项】1.BCG是一种pH指示剂，变色域为pH3.8(显黄色)~5.4(显蓝绿色)，因此控制反应液的 pH 是本法测定的关键。2.配制BCG试剂也可用其他缓冲液如枸橡酸盐或乳酸盐缓冲液。但以琥珀酸盐缓冲液的校正曲线通过原点，线性好，灵敏度高，成为首选推荐配方。3.试剂中的Brij-35也可用其他表面活性剂代替，如吐温-20或吐温-80，终浓度为2ml/L，灵敏度和线性范围不变。4.当60g/L的白蛋白标准液与BCG结合后，溶液光径1.0ml，在630nm处测定的吸光度应为0.811土0.035，如达不到此值，表示灵敏度较差。5.蛋白质标准是一个复杂问题。实验证明，BCG不但与白蛋白呈色，而且与血清中多种蛋白质成分呈色，其中以α1-球蛋白、运铁蛋白、结合珠蛋白更为显著，其反应速度较白蛋白稍慢。由于在30s内呈色对白蛋白特异，故BCG与血清混合后，在30s读取吸光度，可明显减少非特异性呈色反应。为了减少本法基质效应的影响，最好用参考血清作标准。【评价】1.本法操作简便、快速，胆红素、溶血和中度脂血无干扰，，既可手工操作，也能自动化分析，是目前国内测定血清白蛋白的最常用方法。2．本法线性范围为10~60g/L，RCV<4%。但该法与溴甲酚紫法比较，对血清白蛋白特异性稍差。7

7 因大致相同。急性降低主要见于大出血和严重烧伤；慢性降低见于肾病蛋白尿、 肝功能受损、肠道肿瘤及结核病伴慢性出血、营养不良和恶性肿瘤等。血清白蛋 白低于 20g/L，临床上出现水肿。 3．A/G 比值 某些病人可同时出现白蛋白减少和球蛋白升高的现象，严重者 A/G 比值＜1.0，这种情况称为 A/G 比值倒置。 4．文献报导还有极少见的因白蛋白合成障碍，血清中几乎没有白蛋白的先天 性白蛋白缺乏症。 【注意事项】 1．BCG 是一种 pH 指示剂，变色域为 pH3.8(显黄色)～5.4(显蓝绿色)，因此 控制反应液的 pH 是本法测定的关键。 2．配制 BCG 试剂也可用其他缓冲液如枸橼酸盐或乳酸盐缓冲液。但以琥珀 酸盐缓冲液的校正曲线通过原点，线性好，灵敏度高，成为首选推荐配方。 3．试剂中的 Brij-35 也可用其他表面活性剂代替，如吐温-20 或吐温-80，终 浓度为 2ml/L，灵敏度和线性范围不变。 4．当 60g/L 的白蛋白标准液与 BCG 结合后，溶液光径 1.0ml，在 630nm 处 测定的吸光度应为 0.811±0.035，如达不到此值，表示灵敏度较差。 5．蛋白质标准是一个复杂问题。实验证明，BCG 不但与白蛋白呈色，而且 与血清中多种蛋白质成分呈色，其中以α1-球蛋白、运铁蛋白、结合珠蛋白更为显 著，其反应速度较白蛋白稍慢。由于在 30s 内呈色对白蛋白特异，故 BCG 与血清 混合后，在 30s 读取吸光度，可明显减少非特异性呈色反应。为了减少本法基质 效应的影响，最好用参考血清作标准。 【评价】 1．本法操作简便、快速，胆红素、溶血和中度脂血无干扰，既可手工操作， 也能自动化分析，是目前国内测定血清白蛋白的最常用方法。 2．本法线性范围为 10～60g/L，RCV＜4%。但该法与溴甲酚紫法比较，对血 清白蛋白特异性稍差

3．血清白蛋白测定法主要有色氨酸含量法、染料结合法、电泳法、免疫化学法和电化学测定法。附：溴甲酚紫法测定血清白蛋白【原理】在pH5.2的缓冲液中，有Brij-35存在时，溴甲酚紫(bromocresol-puple，BCP)可与白蛋白结合形成绿色复合物，在603nm波长处的吸光度与白蛋白浓度成正比，与同样处理的白蛋白标准比较，便可计算血清中的白蛋白浓度。【试剂与器材】可采用商品试剂或自配。1.250g/LBrij-35溶液见BCG法。2.50mmol/LBCP贮存液称取BCP675mg溶于无水乙醇15ml中，当溶液变为橙色透明时，用无水乙醇稀释至25ml。置4℃冰箱保存至少可稳定3个月。3.BCP试剂称取无水醋酸钠6.03g(或三结晶水的醋酸钠10g)溶于蒸馏水950ml中，加Brij-35液1ml，BCP贮存液1ml，用2.5mol/L醋酸溶液(AR级的醋酸150ml用蒸馏水稀释到1L)调pH至5.20±0.03(约需10ml)，加蒸馏水至IL(BCP贮存液也可在调好pH后再加)。在室温可稳定一周。4.0.154mol/LNaCl溶液称取NaCI9g用蒸馏水溶解到IL。5．白蛋白标准液采用人白蛋白或定值人血清，切不可用动物血清白蛋白。【操作步骤】1．生化自动分析仪分析法参数按仪器说明书的要求设定。2.手工法操作取试管3支，按表7-4操作

8 3．血清白蛋白测定法主要有色氨酸含量法、染料结合法、电泳法、免疫化学 法和电化学测定法。 附：溴甲酚紫法测定血清白蛋白 【原理】 在 pH5.2 的缓冲液中，有 Brij-35 存在时，溴甲酚紫(bromocresol-puple，BCP) 可与白蛋白结合形成绿色复合物，在 603nm 波长处的吸光度与白蛋白浓度成正比，与同样处 理的白蛋白标准比较，便可计算血清中的白蛋白浓度。 【试剂与器材】 可采用商品试剂或自配。 1．250g/L Brij-35 溶液 见 BCG 法。 2．50mmol/L BCP 贮存液 称取 BCP 675mg 溶于无水乙醇 15ml 中，当溶液变为橙色透 明时，用无水乙醇稀释至 25ml。置 4℃冰箱保存至少可稳定 3 个月。 3．BCP 试剂 称取无水醋酸钠 6.03g(或三结晶水的醋酸钠 10g)溶于蒸馏水 950ml 中，加 Brij-35 液 1ml，BCP 贮存液 1ml，用 2.5mol/L 醋酸溶液(AR 级的醋酸 150ml 用蒸馏水稀释到 1L)调 pH 至 5.20±0.03(约需 10ml)，加蒸馏水至 1L(BCP 贮存液也可在调好 pH 后再加)。在室 温可稳定一周。 4．0.154mol/LNaCl 溶液 称取 NaCl 9g 用蒸馏水溶解到 1L。 5．白蛋白标准液 采用人白蛋白或定值人血清，切不可用动物血清白蛋白。 【操作步骤】 1．生化自动分析仪分析法 参数按仪器说明书的要求设定。 2．手工法操作 取试管 3 支，按表 7-4 操作

表 7-4BCP法测定白蛋白操作步骤加入物(ml)空白管标准管测定管血清0.025-0.025白蛋白标准液0.154mol/LNaCI溶液0.0255.05.0BCP试剂5.0混匀，Imin后在波长603m处比色，用空白管调零，读取测定管和标准管吸光度。【计算】L)测定管吸光度×白蛋白标准液浓度(g /L)血清白蛋白(g/ L)标准管吸光度【参考范围】正常成人36~46g/L。【注意事项】1.BCP溶液pH须严格控制在5.20±0.03范围内。2.严重脂肪混浊血清对测定有干扰，应加做标本空白管（血清0.025ml加0.154mol/LNaCl溶液5.0ml)予以校正。【评价】本法反应最适pH为5.20，接近α-和β-球蛋白的等电点，抑制了这两种球蛋白与BCP的非特异性反应，故对测定白蛋白具有高特异性。此外，BCP与白蛋白的反应为即时完全反应，不受时间和温度变化的影响，呈色后稳定1h以上。本法线性范围5~50g/L，在10~40g/L呈良好线性，50g/L时稍偏低：CV为0.45%：回收率99.3%～102%，平均回收率100.5%。本法兼有BCG法的主要优点，克服了BCG法的多数缺点，与火箭电泳法结果相致，成为测定血清白蛋白染料结合法中较好的一个方法。BCP与牛、猪(新鲜或冻干)血清反应性仅为BCG反应的1/3，不适用于动物血清白蛋白作质量控制，机制尚待阐明

9 表 7-4 BCP 法测定白蛋白操作步骤 加入物(ml) 空白管 标准管 测定管 血清 － － 0.025 白蛋白标准液 － 0.025 － 0.154mol/L NaCl 溶液 0.025 － － BCP 试剂 5.0 5.0 5.0 混匀，1min 后在波长 603nm 处比色，用空白管调零，读取测定管和标准管吸光度。 【计算】 (g / L) 白蛋白标准液浓度(g / L) 标准管吸光度 测定管吸光度 血清白蛋白  【参考范围】 正常成人 36～46g/L。 【注意事项】 1．BCP 溶液 pH 须严格控制在 5.20±0.03 范围内。 2．严重脂肪混浊血清对测定有干扰，应加做标本空白管(血清 0.025ml 加 0.154mol/L NaCl 溶液 5.0ml)予以校正。 【评价】 本法反应最适 pH 为 5.20，接近α-和β-球蛋白的等电点，抑制了这两种球蛋 白与 BCP 的非特异性反应，故对测定白蛋白具有高特异性。此外，BCP 与白蛋白的反应为即 时完全反应，不受时间和温度变化的影响，呈色后稳定 1h 以上。本法线性范围 5～50g/L，在 10～40g/L 呈良好线性，50g/L 时稍偏低；CV 为 0.45%；回收率 99.3%～102%，平均回收率 100.5%。本法兼有 BCG 法的主要优点，克服了 BCG 法的多数缺点，与火箭电泳法结果相一 致，成为测定血清白蛋白染料结合法中较好的一个方法。BCP 与牛、猪(新鲜或冻干)血清反应 性仅为 BCG 反应的 1/3，不适用于动物血清白蛋白作质量控制，机制尚待阐明

实验36免疫透射比浊法测定前白蛋白血清前白蛋白(pre-albumin，PA)是由4个相同亚基组成的四聚体，分子量为55.0kD，含糖量0.5%，含色氨酸3.15%。在pH8.6时的电泳速度较白蛋白(Alb)快(约快25%)。其在体内的半衰期(ti/2)(1.9d)明显比AIb(17~21d)短。血清PA测定目前以免疫比浊法应用最多，其次是免疫扩散技术。免疫比浊法以其测定原理，可分散射比浊(nephelometry)和透射比浊(turbidimetry)二类。前者是利用溶液中抗原抗体反应形成的复合物微粒被一定波长的光照射时发生散射，通过检测散射光强度，计算出样品中PA量。后者则是基于抗原抗体复合物微粒形成后，使透过光减少，根据吸光度值推算PA量。本文介绍免疫透射比浊法测定前白蛋白。【原理】当抗体(即抗PA)浓度过量且固定时，抗体与被测抗原(PA)反应所形成的免疫复合物的量与吸光度值成正比，即与样品中PA量成正比。【试剂】1.20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)。2.50g/L聚乙二醇(PEG)-6000溶液称取5gPEG-6000，NaN3100mg，用20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)溶解，并加至100ml刻度，混匀，4℃保存。3.样品稀释液取20mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4)100ml，加Brij-3530mg溶解后于4℃保存。4.前白蛋白抗血清(抗PA)应用液抗PA(效价1：60，上海生物制品研究所生产）1ml加50g/L聚乙二醇(PEG）溶液5.0ml，混匀，4℃放置24h，3000r/min离心30min，弃沉淀，上清液为抗PA应用液5.PA参考血清PA参考血清复溶后，用样品稀释液稀释成相当于原血清PA浓度0.05、0.10、0.20、0.30、0.40g/L。【操作步骤】1.标本血清、血浆均可用，以用血清者居多。宜空腹采静脉血。血清按常10

10 实验 36 免疫透射比浊法测定前白蛋白 血清前白蛋白(pre-albumin，PA)是由 4 个相同亚基组成的四聚体，分子量为 55.0kD，含糖量 0.5%，含色氨酸 3.15%。在 pH8.6 时的电泳速度较白蛋白(Alb)快 (约快 25%)。其在体内的半衰期(t1/2)(1.9d)明显比 Alb(17～21d)短。 血清 PA 测定目前以免疫比浊法应用最多，其次是免疫扩散技术。免疫比浊法 以其测定原理，可分散射比浊(nephelometry)和透射比浊(turbidimetry)二类。前者 是利用溶液中抗原抗体反应形成的复合物微粒被一定波长的光照射时发生散射， 通过检测散射光强度，计算出样品中 PA 量。后者则是基于抗原抗体复合物微粒形 成后，使透过光减少，根据吸光度值推算 PA 量。 本文介绍免疫透射比浊法测定前白蛋白。 【原理】 当抗体(即抗 PA)浓度过量且固定时，抗体与被测抗原(PA)反应所形 成的免疫复合物的量与吸光度值成正比，即与样品中 PA 量成正比。 【试剂】 1．20mmol/L 磷酸盐缓冲液(pH7.4)。 2．50g/L 聚乙二醇(PEG)-6000 溶液 称取 5g PEG-6000，NaN3 100mg，用 20mmol/L 磷酸盐缓冲液(pH7.4)溶解，并加至 100ml 刻度，混匀，4℃保存。 3．样品稀释液 取 20mmol/L 磷酸盐缓冲液(pH 7.4)100ml，加 Brij-35 30 mg 溶解后于 4℃保存。 4．前白蛋白抗血清(抗 PA)应用液 抗 PA(效价 1：60，上海生物制品研究所 生产)1ml 加 50g/L 聚乙二醇(PEG)溶液 5.0ml，混匀，4℃放置 24h，3 000r/min 离 心 30min，弃沉淀，上清液为抗 PA 应用液 5．PA 参考血清 PA 参考血清复溶后，用样品稀释液稀释成相当于原血清 PA 浓度 0.05、0.10、0.20、0.30、0.40 g/L。 【操作步骤】 1．标本 血清、血浆均可用，以用血清者居多。宜空腹采静脉血。血清按常