《临床生物化学》课程教学资源(实验指导)第15章 常用治疗性药物监测

第十五章常用治疗性药物监测治疗药物监测(Therapeuticdrugmonitoring,TDM)的目的是研究生物体液中的药物浓度疗效和毒性的关系,并利用药代动力学的原理和公式设计出给药的最佳治疗剂量,提高药物疗效和减少不良反应的发生,使给药方案个体化。目前临床上可以检测的项目已达80余种并在继续开发中。常用的有抗癫痫药物如苯妥英、卡马西平、丙戊酸钠;氨基糖苷类抗生素如庆大霉素、丁胺卡那霉素;抗心律失常药物如奎尼丁、利多卡因及其衍生物;抗哮喘药物如氨茶碱;心糖苷类如地高辛;内分泌激素如雌三醇;免疫抑制剂如环孢素A要实施TDM的药物必须符合以下基本条件:①药物浓度变化可以反映药物作用部位的浓度变化;②药效与药物浓度的相关性超过与剂量的相关性;③效应不能用间接指标评价的药物;④已知有效浓度范围;③测定血药浓度方法的特异性、敏感性及精确性均较高,并且快速简便。此外需要测定的药物还需备有相应的检测试剂盒。目前常用的血药浓度测定法有分光光度法、HPLC法、RIA法、EMIT、FPIA和原子吸收光谱法等,本章以几个常用治疗药物为例选用不同方法进行介绍。实验111双波长紫外分光光度法测定血清茶碱及药代动力学参数计算【原理】氨茶碱为茶碱和乙二胺缩合而成,在体液中解离出茶碱发挥作用。在酸性条件下,可用有机溶剂从血清中提取出茶碱,并同时沉淀血清蛋白;再用碱液把茶碱从有机溶剂中提取出来。在入274和入298s处测定碱性提取液的吸光度(A),A274为茶碱和本底(溶剂、血清)的总吸光度,A298为本底的吸光度。茶碱的吸光度应为△A=A274-A298,根据校正曲线的回归方程即可求出样品的茶碱浓度。氨茶碱静注进入血液后,随血液循环进行组织分布,达到平衡后转入消除相。消除速率小于分布速率,药-时曲线显二室动力学模型曲线特征。据用药后不同时间取血测得的茶碱浓度,可求算出茶碱的药代动力学参数【试剂】1.0.1mol/L盐酸溶液。2.0.1mol/LNaOH溶液。3.异丙醇-氯仿溶液(1:19)取异丙醇25ml加到475ml氯仿中,混匀。4.0.5mg/ml茶碱标准液称取茶碱标准品5.0mg,加乙醇5ml溶解,再加蒸馏水定容至10ml,置4℃备用
1 第十五章 常用治疗性药物监测 治疗药物监测(Therapeutic drug monitoring,TDM)的目的是研究生物体液中的药物浓度、 疗效和毒性的关系,并利用药代动力学的原理和公式设计出给药的最佳治疗剂量,提高药物 疗效和减少不良反应的发生,使给药方案个体化。目前临床上可以检测的项目已达 80 余种, 并在继续开发中。常用的有抗癫痫药物如苯妥英、卡马西平、丙戊酸钠;氨基糖苷类抗生素 如庆大霉素、丁胺卡那霉素;抗心律失常药物如奎尼丁、利多卡因及其衍生物;抗哮喘药物 如氨茶碱;心糖苷类如地高辛;内分泌激素如雌三醇;免疫抑制剂如环孢素 A。 要实施 TDM 的药物必须符合以下基本条件:①药物浓度变化可以反映药物作用部位的 浓度变化;②药效与药物浓度的相关性超过与剂量的相关性;③效应不能用间接指标评价的 药物;④已知有效浓度范围;⑤测定血药浓度方法的特异性、敏感性及精确性均较高,并且 快速简便。此外需要测定的药物还需备有相应的检测试剂盒。 目前常用的血药浓度测定法有分光光度法、HPLC 法、RIA 法、EMIT、FPIA 和原子吸收 光谱法等,本章以几个常用治疗药物为例选用不同方法进行介绍。 实验 111 双波长紫外分光光度法测定血清茶碱及药代动力学参数计算 【原理】 氨茶碱为茶碱和乙二胺缩合而成,在体液中解离出茶碱发挥作用。在酸性条 件下,可用有机溶剂从血清中提取出茶碱,并同时沉淀血清蛋白;再用碱液把茶碱从有机溶 剂中提取出来。在λ274 和λ298 处测定碱性提取液的吸光度(A),A274 为茶碱和本底(溶剂、血 清)的总吸光度,A298 为本底的吸光度。茶碱的吸光度应为△A=A274-A298,根据校正曲线的回 归方程即可求出样品的茶碱浓度。 氨茶碱静注进入血液后,随血液循环进行组织分布,达到平衡后转入消除相。消除速率 小于分布速率,药-时曲线显二室动力学模型曲线特征。据用药后不同时间取血测得的茶碱浓 度,可求算出茶碱的药代动力学参数。 【试剂】 1.0.1mol/L 盐酸溶液。 2.0.1mol/L NaOH 溶液。 3.异丙醇-氯仿溶液(1:19) 取异丙醇 25ml 加到 475ml 氯仿中,混匀。 4.0.5mg/ml 茶碱标准液 称取茶碱标准品 5.0mg,加乙醇 5ml 溶解,再加蒸馏水定容至 10ml,置 4℃备用

5. 氨茶碱注射液(25mg/ml)。【操作步骤】1.动物准备选体重2~3kg、耳静脉清晰无损的健康家兔,称量,将准备给药和取血的耳缘静脉部位的毛剪除。2.静脉给药按15mg/kg体重吸取氨茶碱注射液,从一侧耳缘静脉穿刺缓缓注入,推注时间不少于2min。注射完拔针后,以干棉球按压穿刺处数分钟止血。3.取血在另耳选择耳缘静脉近耳根粗大处,以锋利刀片在静脉壁上作一小切口,但慎勿切断动脉。分别于给药后Omin,10min,20min,30min,1h,2h,3h,5h和7h收集滴血约2ml,每次取血后以棉球压迫切开处止血,下次取血时擦去凝血块即可。若流血不畅,可用酒精或二甲苯棉球擦兔耳背,扩张血管,但勿接触取血处,以免溶血,4.血清的分离全血置室温30min,待血液凝固析出血清后离心分离。5.茶碱校正曲线制作按表15-1操作。表15-1茶碱校正曲线制作操作步骤加入物空白管123540.5mg/ml茶碱标准液(μ)12.020.008.016.04.04.04.04.04.04.00. 1mol/LNaOH 溶液(ml)00.51.01.52.02.5浓度(mg/L)△A(A=A274—A298)测定各管溶液的A274和A298,并计算出△A值,以溶液浓度(C)为横坐标,△A值为纵坐标,绘成直线即为校正曲线,并用线性回归法求出直线方程:△A=a+bc6.血清茶碱浓度测定吸取血清0.5ml置试管中,加0.1mol/L盐酸溶液0.2ml、异丙醇氯仿溶液(1:19)5ml,振荡混匀,2500r/min离心10min,吸取下层氯仿液4.0ml置另一试管中,加入0.1mo/LNaOH溶液4.0ml,振荡混匀,2.500r/min离心10min,以空白管溶液作参比,吸取上层碱性提取液于入274和入298处测定其吸光度(A274和A298),计算出△A。【计算】1.血清茶碱浓度测得的血清样品△A,可从校正曲线上查得相应的C,C×10即为茶碱的血药浓度(mg/L)。也可根据直线方程计算出茶碱的血药浓度C,再乘以10(稀释因子)。2.药代动力学参数(1)药-时曲线以时间(t)为横坐标,血药茶碱浓度的对数(IgC)为纵坐标,在半对数坐标纸上绘出药-时曲线
2 5.氨茶碱注射液(25mg/ml)。 【操作步骤】 1.动物准备 选体重 2~3kg、耳静脉清晰无损的健康家兔,称量,将准备给药和取血的 耳缘静脉部位的毛剪除。 2.静脉给药 按 15mg/kg 体重吸取氨茶碱注射液,从一侧耳缘静脉穿刺缓缓注入,推注 时间不少于 2min。注射完拔针后,以干棉球按压穿刺处数分钟止血。 3.取血 在另耳选择耳缘静脉近耳根粗大处,以锋利刀片在静脉壁上作一小切口,但慎 勿切断动脉。分别于给药后 0min,10min,20min,30min,1h,2h,3h,5h 和 7h 收集滴血 约 2ml,每次取血后以棉球压迫切开处止血,下次取血时擦去凝血块即可。若流血不畅,可 用酒精或二甲苯棉球擦兔耳背,扩张血管,但勿接触取血处,以免溶血。 4.血清的分离 全血置室温 30min,待血液凝固析出血清后离心分离。 5.茶碱校正曲线制作 按表 15-1 操作。 表 15-1 茶碱校正曲线制作操作步骤 加入物 空白管 1 2 3 4 5 0.5mg/ml 茶碱标准液(μl) 0 4.0 8.0 12.0 16.0 20.0 0.1mol/LNaOH 溶液(ml) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 浓度(mg/L) 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 △A(△A=A274—A298) 测定各管溶液的 A274 和 A298,并计算出△A 值,以溶液浓度(C)为横坐标,△A 值为纵 坐标,绘成直线即为校正曲线,并用线性回归法求出直线方程: △A=a+bC 6.血清茶碱浓度测定 吸取血清 0.5ml 置试管中,加 0.1mol/L 盐酸溶液 0.2ml、异丙醇- 氯仿溶液(1:19)5ml,振荡混匀,2 500r/min 离心 10min,吸取下层氯仿液 4.0ml 置另一试管 中,加入 0.1mol/L NaOH 溶液 4.0ml,振荡混匀,2 500r/min 离心 10min,以空白管溶液作参 比,吸取上层碱性提取液于λ274 和λ298处测定其吸光度(A274和 A298),计算出△A。 【计算】 1.血清茶碱浓度 测得的血清样品△A,可从校正曲线上查得相应的 C,C×10 即为茶 碱的血药浓度(mg/L)。也可根据直线方程计算出茶碱的血药浓度 C,再乘以 10(稀释因子)。 2.药代动力学参数 (1) 药-时曲线 以时间(t)为横坐标,血药茶碱浓度的对数(lgC)为纵坐标,在半对数坐标 纸上绘出药-时曲线

(2)以药代动力学参数计算程序或残差法求下列参数A、B、a、β、Vd、kio、ki2、k1并写出药-时曲线方程C=A-αt+B-βt。具体计算参见有关药代动力学书籍。【参考范围】茶碱有效血药浓度范围及有关参数,见表15-2。表15-2茶碱有效血药浓度及有关参数表有关参数有效血药浓度范围(mg/L)5~20>20潜在中毒浓度(mg/L)常用维持剂量(mg/kg·d)成人10~1320~ 24 儿童(1~12岁)口服吸收率(%)95~ 100达峰浓度时间(h)2~3分布容积(L/kg)0.5(0.35~0.70)消除半寿期(h)成人3~8儿童1~8 达稳态时间(h)16~37成人儿童6~44血浆清除率(ml/kg*min)成人0.54~0.80儿童1.1~1.9血浆蛋白结合率55~60【临床意义】茶碱为一种甲基黄嘌呤生物碱,是一种有效的预防和治疗支气管哮喘的药物,但其有效治疗浓度范围窄,个体差异大,其平喘疗效和毒性反应与血药浓度密切相关其有效血药浓度参考值为5~20mg/L(27.8~111.0μmol/L),当血药浓度超过25mg/L(138.8umol/L),约75%的病人出现毒性反应,超过35mg/L(194.3μmol/L)后,容易发生致死性心律失常。因此临床上对茶碱进行治疗药物监测及药代动力学参数的测定是十分必要的。【注意事项】1.不要在给药侧免耳取血。2.药物应一次注射完,勿推注过快,以免免产生心脏毒性死亡。3
3 (2) 以药代动力学参数计算程序或残差法求下列参数 A、B、α、β、Vd、k10、k12、k21, 并写出药-时曲线方程 C=A-αt+B-βt。具体计算参见有关药代动力学书籍。 【参考范围】 茶碱有效血药浓度范围及有关参数,见表 15-2。 表 15-2 茶碱有效血药浓度及有关参数表 有关参数 有效血药浓度范围(mg/L) 5~20 潜在中毒浓度(mg/L) >20 常用维持剂量(mg/kg·d) 成人 10~13 儿童(1~12 岁) 20~24 口服吸收率(%) 95~100 达峰浓度时间(h) 2~3 分布容积(L/kg) 0.5(0.35~0.70) 消除半寿期(h) 成人 3~8 儿童 1~8 达稳态时间(h) 成人 16~37 儿童 6~44 血浆清除率(ml/kg·min) 成人 0.54~0.80 儿童 1.1~1.9 血浆蛋白结合率 55~60 【临床意义】 茶碱为一种甲基黄嘌呤生物碱,是一种有效的预防和治疗支气管哮喘的 药物,但其有效治疗浓度范围窄,个体差异大,其平喘疗效和毒性反应与血药浓度密切相关。 其有效血药浓度参考值为 5~20mg/L(27.8~111.0μmol/L),当血药浓度超过 25mg/L(138.8μ mol/L),约 75%的病人出现毒性反应,超过 35mg/L(194.3μmol/L)后,容易发生致死性心律失 常。因此临床上对茶碱进行治疗药物监测及药代动力学参数的测定是十分必要的。 【注意事项】 1.不要在给药侧兔耳取血。 2.药物应一次注射完,勿推注过快,以免兔产生心脏毒性死亡

3.若未能按时取血或取血困难耗时长,应如实记录每次实际取血开始至完毕的终点时间,作为药代动力学计算时间。【评价】茶碱的血药浓度监测方法有双波长紫外分光光度法(UV)、三波长紫外分光光度法、二阶导数紫外分光光度法、荧光分光光度法、薄层色谱法、气相色谱法(GC)、高效液相色谱(HPLC)、放射免疫分析法(RIA)、酶放大免疫测定技术(enzyme-multiplied immunoassaytechnique,EMIT)、荧光偏振免疫分析(FPIA)、胶束电动毛细管色谱法和免疫色谱法等多种方法,但临床上监测茶碱常用的方法主要为UV法、HPLC和FPIA三种。茶碱在入274有最大的吸收,但与分离过程中的杂质吸收光谱重叠,杂质在入274和入298处有同等吸收。故采用双波长法分别在入274和入298处测定吸光值,可排除干扰。该法血清茶碱浓度在25.0mg/L以内与紫外吸收强度呈线性关系(r-0.9997),回收率为95.4%(n=5.CV=2.43%)。饮用茶、咖啡及同时使用保太松或磺胺类药物,可干扰测定UV法的优点是仪器较便宜、试剂价格低廉,成本低,操作简便,比较适合一般医院开展茶碱血药监测。缺点是一次测定所需的血清量较多,血样处理繁杂费时,需每天校准,精密度、灵敏度和专一性不及HPLC和FPIA法。HPLC法方法成熟,灵敏度、分辨率较UV法好,流动相可反复使用,平衡较快,但该法操作繁琐;FPIA法,专一性强,几乎不受其他药物与杂质的干扰,精密度和灵敏度高,需要样品量小,快速简便,不需每天校准,但仪器设备昂贵、试剂盒大多需国外进口,价格昂贵,成本较高,不易普及。实验112化学发光酶免疫法测定地高辛【原理】采用磁性微粒作为固相载体,以碱性磷酸酶作为发光剂,以竞争法等免疫测定方法为基础。即顺磁性铁固体颗粒外包被羊抗兔IgG与包被地高辛单克隆抗体结合后,再与标本中的地高辛或定量标记的牛碱性磷酸酶-地高辛IgG抗体竞争形成免疫复合物,洗去未结合的标记物,再加碱性磷酸酶发光底物Lumi-phos*530,底物去磷酸化放出光,测定其放出的光量子,与标准比较即可定量。【试剂与器材】1.地高辛标准液。2.地高辛化学发光免疫分析试剂盒,包括下列试剂:(1)顺磁性铁固体颗粒:直径4mm,外包被1mg/ml羊抗免IgG。(2)4.0ng/ml包被地高辛-单克隆抗体。(3)2267U/ml牛碱性磷酸酶标记的地高辛IgG抗体
4 3.若未能按时取血或取血困难耗时长,应如实记录每次实际取血开始至完毕的终点时 间,作为药代动力学计算时间。 【评价】 茶碱的血药浓度监测方法有双波长紫外分光光度法(UV)、三波长紫外分光光 度法、二阶导数紫外分光光度法、荧光分光光度法、薄层色谱法、气相色谱法(GC)、高效液 相色谱(HPLC)、放射免疫分析法(RIA)、酶放大免疫测定技术(enzyme-multiplied immunoassay technique,EMIT)、荧光偏振免疫分析(FPIA)、胶束电动毛细管色谱法和免疫色谱法等多种方 法,但临床上监测茶碱常用的方法主要为 UV 法、HPLC 和 FPIA 三种。 茶碱在λ274 有最大的吸收,但与分离过程中的杂质吸收光谱重叠,杂质在λ274 和λ298 处有同等吸收。故采用双波长法分别在λ274 和λ298 处测定吸光值,可排除干扰。该法血清茶 碱浓度在 25.0mg/L 以 内 与 紫 外 吸 收 强 度 呈 线 性 关 系 (r=0.9997) , 回 收 率 为 95.4%(n=5,CV=2.43%)。饮用茶、咖啡及同时使用保太松或磺胺类药物,可干扰测定。 UV 法的优点是仪器较便宜、试剂价格低廉,成本低,操作简便,比较适合一般医院开 展茶碱血药监测。缺点是一次测定所需的血清量较多,血样处理繁杂费时,需每天校准,精 密度、灵敏度和专一性不及 HPLC 和 FPIA 法。HPLC 法方法成熟,灵敏度、分辨率较 UV 法 好,流动相可反复使用,平衡较快,但该法操作繁琐;FPIA 法,专一性强,几乎不受其他药 物与杂质的干扰,精密度和灵敏度高,需要样品量小,快速简便,不需每天校准,但仪器设 备昂贵、试剂盒大多需国外进口,价格昂贵,成本较高,不易普及。 实验 112 化学发光酶免疫法测定地高辛 【原理】 采用磁性微粒作为固相载体,以碱性磷酸酶作为发光剂,以竞争法等免疫测 定方法为基础。即顺磁性铁固体颗粒外包被羊抗兔 IgG 与包被地高辛单克隆抗体结合后,再 与标本中的地高辛或定量标记的牛碱性磷酸酶-地高辛 IgG 抗体竞争形成免疫复合物,洗去未 结合的标记物,再加碱性磷酸酶发光底物 Lumi-phos*530,底物去磷酸化放出光,测定其放出 的光量子,与标准比较即可定量。 【试剂与器材】 1.地高辛标准液。 2.地高辛化学发光免疫分析试剂盒,包括下列试剂: (1) 顺磁性铁固体颗粒:直径 4mm,外包被 1mg/ml 羊抗兔 IgG。 (2) 4.0ng/ml 包被地高辛-单克隆抗体。 (3) 2267U/ml 牛碱性磷酸酶标记的地高辛 IgG 抗体

(4)发光剂:Lumi-phos*530,其化学名称为4-甲氧基-β-磷酸苯酯)螺-(1,2-二氧杂环丁烷-3,2-三环癸烷)磷酸钠,浓度为0.14mg/ml。3.Beckman Access粒子全自动化学发光免疫分析仪:它采用微粒子化学发光技术对人体内的微量成份以及药物浓度进行定量测定,是微电脑控制的,可以定量检测多种项目的全自动组合仪器,全自动操作,一次可对60份标本进行24种项目的测定,只需10min~30min就可完成第一个测定并打印出结果。它主要由六部分组成:①传送舱:②主探针系统:③分析系统;④流体系统;③电子系统;③外周设备。使用化学发光法的其他仪器有美国CibaCorming公司生产的ACS-180SE全自动化学发光免疫分析仪、原德国宝灵曼现Roche产的Elecys1010或Elecys2010型全自动电化学发光免疫分析仪和美国雅培(Abbott)公司产的AxSYM全自动酶免疫分析仪等。以Access 粒子全自动化学发光免疫分析仪及其配套的地高辛检测试剂盒【操作步骤】为例,简要的操作步骤如下(具体详见操作说明书):·血标本采集患者口服地高辛,每日2次,连服6天以上,达到稳态血药浓度,即半个半寿期,并在末次服药后6~8h采血,及时分离血清,一般要求4h以内测定血清地高辛浓度。2.试剂装载:取出试剂,扫描试剂盒条形码,轻轻混匀试剂,打开试剂转盘上盖,放入试剂,关闭上盖。3.校正曲线的绘制或定标新的试剂盒若与前一个试剂盒批号不一致,这时需重新制作校正曲线或定标,用含地高辛0,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0μg/L的地高辛定值血清上机进行测定,得到地高辛的校正曲线。校正曲线绘制运用四逻辑参数系统软件,如仪器通过则表示校正曲线制作成功。一般校正曲线可稳定28d。4.上机测定:将血清放入上机专用试管,按顺序装至标本架中,1次测定地高辛的血清量仅需55ul,按需测定的项目数加入所需量,按照以下操作规程进行:(1)在主屏下,按[F1]键Test Request/Progress(测定需要)。(2)输入架子号、标本号和项目编号。(3)按[F1]Load Tray(装标本架)于仪器中,按[F1JDone(确认)。(4)按[F11]Run(运行),再按[F8]JContinue(继续),仪器开始自动测定(5)标本测定运行结束之后,按[F4]ViewTestResults(观察结果),用上下键移到指定位置然后用空格键选中使之变黄,待其它项目都选中之后,按[F5JSelected Results ToLIS传送数据在视窗监视下,观察提示和运行轨道项目状态。通常20min打出第一个样本报告,每隔20s打出另一样本报告
5 (4) 发光剂:Lumi-phos*530,其化学名称为 4-甲氧基-β-磷酸苯酯)-螺-(1,2-二氧杂环丁 烷-3,2-三环癸烷)磷酸钠,浓度为 0.14mg/ml。 3.Beckman Access 粒子全自动化学发光免疫分析仪:它采用微粒子化学发光技术对人体 内的微量成份以及药物浓度进行定量测定,是微电脑控制的,可以定量检测多种项目的全自 动组合仪器,全自动操作,一次可对 60 份标本进行 24 种项目的测定,只需 10min~30min 就可完成第一个测定并打印出结果。它主要由六部分组成:①传送舱;②主探针系统;③分 析系统;④流体系统;⑤电子系统;⑥外周设备。使用化学发光法的其他仪器有美国 Ciba Corning 公司生产的 ACS-180SE 全自动化学发光免疫分析仪、原德国宝灵曼现 Roche 产的 Elecys1010 或 Elecys 2010 型全自动电化学发光免疫分析仪和美国雅培(Abbott)公司产的 AxSYM 全自动酶免疫分析仪等。 【操作步骤】 以 Access 粒子全自动化学发光免疫分析仪及其配套的地高辛检测试剂盒 为例,简要的操作步骤如下(具体详见操作说明书): 1.血标本采集 患者口服地高辛,每日 2 次,连服 6 天以上,达到稳态血药浓度,即半 个半寿期,并在末次服药后 6~8h 采血,及时分离血清,一般要求 4h 以内测定血清地高辛浓 度。 2.试剂装载:取出试剂,扫描试剂盒条形码,轻轻混匀试剂,打开试剂转盘上盖,放入 试剂,关闭上盖。 3.校正曲线的绘制或定标 新的试剂盒若与前一个试剂盒批号不一致,这时需重新制作 校正曲线或定标,用含地高辛 0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0μg/L 的地高辛定值血清上机进行测 定,得到地高辛的校正曲线。校正曲线绘制运用四逻辑参数系统软件,如仪器通过则表示校 正曲线制作成功。一般校正曲线可稳定 28d。 4.上机测定:将血清放入上机专用试管,按顺序装至标本架中,1 次测定地高辛的血清 量仅需 55μl,按需测定的项目数加入所需量,按照以下操作规程进行: (1) 在主屏下,按[F1]键 Test Request/Progress(测定需要)。 (2) 输入架子号、标本号和项目编号。 (3) 按[F1]Load Tray(装标本架)于仪器中,按[F1]Done(确认)。 (4) 按[F11]Run(运行),再按[F8]Continue(继续),仪器开始自动测定。 (5) 标本测定运行结束之后,按[F4]View Test Results(观察结果),用上下键移到指定位置, 然后用空格键选中使之变黄,待其它项目都选中之后,按[F5]Selected Results To LIS 传送数据。 在视窗监视下,观察提示和运行轨道项目状态。通常 20min 打出第一个样本报告,每隔 20s 打出另一样本报告

【参考范围】 治疗血药浓度范围 0.8~2.0 μg/L。【临床意义】地高辛是一种作用于心脏的强心试类药物,主要用于充血性心力衰竭和某些心律失常的治疗。由于地高辛治疗指数低,安全范围窄,如果其有效治疗剂量接近中毒剂量,通常地高辛治疗血药浓度范围介于0.8~2.0μg/L,地高辛稳态血浓度3.0ug/l可视为中毒浓度。此外,由于地高辛药代动力学和药效学个体差异大等原因,常易发生剂量不足或中毒现象,因此在应用地高辛治疗过程中监测血药浓度,对控制用药剂量和防止中毒具有极其重要的意义【注意事项】使用全自动化学发光免疫分析仪应注意仪器的每日保养和每周保养工作程序。【评价】目前测定地高辛的方法有放射免疫法(RIA)、化学发光酶免疫分析法(chemiluminescent enzyme immunoassay,CLEIA)、荧光偏振免疫分析法(FPIA)、酶放大免疫测定技术(EMIT)和酶联免疫吸附试验法(ELISA)。RIA 法优点是其成本低廉和灵敏度高,缺点是其放射性污染和放射性标记物半寿期短及批间RSD普遍偏大,且其检测时间过长很难适应临床检验的即时之需。EMIT法仅能检测小分子抗原或半抗原。ELISA法灵敏度高,但其所有底物中大部分有毒或为致癌物,此外酶的稳定性极易受温度和pH值的影响。FPIA法操作简便、快速省时、灵敏度高,结果准确,稳定性好,比较适应临床检验,但灵敏度不及RIA,且易受本底荧光的干扰。CLEIA法采用全自动恒温顺磁性铁微粒子混匀及单克隆抗体分离系统,底物发光剂发光时间可稳定在20min,测定灵敏度高,相当于pg水平,且无污染,样品用量少,所需时间短(整个测定时间为20min),能适合临床检验即时之需。采用全自动化学发光免疫试剂盒,其地高辛的校正曲线回归方程为Y=0.989X+0.015F-0.9885。检测限为0.026ug/L,回收率91.67%~97.56%,批内CV为2.58%,批间CV为5.13%实验 113HPLC法测定血清苯妥英【原理】当化学结构不同的物质通过色谱分析柱时,因其理化性质的差异,它们在柱上保留时间不同,极性强的物质在反相C18柱上的保留时间短,出峰快;极性弱的物质则相反。因此,经色谱柱可把苯妥英(phenytoin)与其他杂质分离。血清样品加甲醇沉淀蛋白,上清液进样测定,据苯妥英峰高,从校正曲线方程求出苯妥英的浓度。6
6 【参考范围】 治疗血药浓度范围 0.8~2.0μg/L。 【临床意义】 地高辛是一种作用于心脏的强心甙类药物,主要用于充血性心力衰竭和 某些心律失常的治疗。由于地高辛治疗指数低,安全范围窄,如果其有效治疗剂量接近中毒 剂量,通常地高辛治疗血药浓度范围介于 0.8~2.0μg/L,地高辛稳态血浓度<0.8μg/L,一 般认为治疗无效,且无毒性反应。2.0~3.0μg/L 为治疗及中毒血浓度交叉范围。>3.0μg/L 可视为中毒浓度。此外,由于地高辛药代动力学和药效学个体差异大等原因,常易发生剂量 不足或中毒现象,因此在应用地高辛治疗过程中监测血药浓度,对控制用药剂量和防止中毒 具有极其重要的意义。 【注意事项】 使用全自动化学发光免疫分析仪应注意仪器的每日保养和每周保养工作 程序。 【评价】 目前测定地 高辛的方法有放 射免疫法(RIA)、化学发光酶免疫分析法 (chemiluminescent enzyme immunoassay, CLEIA)、荧光偏振免疫分析法(FPIA)、酶放大免疫测 定技术(EMIT)和酶联免疫吸附试验法(ELISA)。RIA 法优点是其成本低廉和灵敏度高,缺点是 其放射性污染和放射性标记物半寿期短及批间 RSD 普遍偏大,且其检测时间过长很难适应临 床检验的即时之需。EMIT 法仅能检测小分子抗原或半抗原。ELISA 法灵敏度高,但其所有 底物中大部分有毒或为致癌物,此外酶的稳定性极易受温度和 pH 值的影响。FPIA 法操作简 便、快速省时、灵敏度高,结果准确,稳定性好,比较适应临床检验,但灵敏度不及 RIA, 且易受本底荧光的干扰。 CLEIA 法采用全自动恒温顺磁性铁微粒子混匀及单克隆抗体分离系统,底物发光剂发光 时间可稳定在 20min,测定灵敏度高,相当于 pg 水平,且无污染,样品用量少,所需时间短 (整个测定时间为 20min),能适合临床检验即时之需。 采用全自动化学发光免疫试剂盒,其地高辛的校正曲线回归方程为 Y=0.989X+0.015, r=0.9885。检测限为 0.026μg/L, 回收率 91.67%~97.56%, 批内 CV 为 2.58%, 批间 CV 为 5.13%。 实验 113 HPLC 法测定血清苯妥英 【原理】 当化学结构不同的物质通过色谱分析柱时,因其理化性质的差异,它们在柱 上保留时间不同,极性强的物质在反相 C18 柱上的保留时间短,出峰快;极性弱的物质则相 反。因此,经色谱柱可把苯妥英(phenytoin)与其他杂质分离。血清样品加甲醇沉淀蛋白,上 清液进样测定,据苯妥英峰高,从校正曲线方程求出苯妥英的浓度

【试剂】.甲醇(色谱纯)。2.200mg/L苯妥英标准液称取苯妥英20mg溶于甲醇中,加甲醇定容至100ml,4℃保存备用。3.内标示200mg/L苯乙酮甲醇液,称取苯乙酮10mg溶于甲醇中,加甲醇定容至50ml4℃保存备用。【操作步骤】1.血样的采集患者血药浓度达到稳态后,于下次给药前或早晨服药前采血,待血清析出,分离血清。2.校正曲线制作及样品测定按表15-3操作表 15-3 校正曲线制作及样品测定操作步骤加入物空白管测定管2A0.10.10.1对照血清(ml)0.10.11.05.010.015.025.0苯妥英标准(uI)-一25.020.025.0甲醇(μI)24.015.010.00.1 待测血清(ml)一50.00.02.010.020.030.0血清苯妥英浓度(mg/L)以上各管中加入0.04ml内标液和0.3ml甲醇,旋涡混合器上振荡30s,4000r/min离心15min,分离出上清液,取20u1进样测定,以苯妥英钠面积与内标峰面积的比值为纵坐标,苯妥英浓度(mg/L)为横坐标,绘制校正曲线,并进行线性回归求出校正曲线方程。3.色谱条件(1)SymmetryC18反相柱:150mmX3.9mm,5μm。(2)流动相:甲醇/蒸馏水(1:1,V/V)。(3)流速:1.0ml/min。(4)检测波长:210nm。(5)灵敏度:0.01AUFS【计算】据待测样品峰高值从校正曲线上查出相应浓度或由校正曲线方程求得。【参考范围】苯妥英的有效血药浓度范围及有关参数见表15-4
7 【试剂】 1.甲醇(色谱纯)。 2.200mg/L 苯妥英标准液 称取苯妥英 20mg 溶于甲醇中,加甲醇定容至 100ml,4℃保 存备用。 3.内标 200mg/L 苯乙酮甲醇液,称取苯乙酮 10mg 溶于甲醇中,加甲醇定容至 50ml, 4℃保存备用。 【操作步骤】 1.血样的采集 患者血药浓度达到稳态后,于下次给药前或早晨服药前采血,待血清析 出,分离血清。 2.校正曲线制作及样品测定 按表 15-3 操作。 表 15-3 校正曲线制作及样品测定操作步骤 加入物 空白管 1 2 3 4 5 测定管 对照血清(ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 — 苯妥英标准(μl) — 1.0 5.0 10.0 15.0 25.0 — 甲醇(μl) 25.0 24.0 20.0 15.0 10.0 — 25.0 待测血清(ml) — — — — — — 0.1 血清苯妥英浓度(mg/L) 0.0 2.0 10.0 20.0 30.0 50.0 以上各管中加入 0.04ml 内标液和 0.3ml 甲醇,旋涡混合器上振荡 30s,4 000r/min 离心 15min,分离出上清液,取 20μl 进样测定,以苯妥英钠面积与内标峰面积的比值为纵坐标, 苯妥英浓度(mg/L)为横坐标,绘制校正曲线,并进行线性回归求出校正曲线方程。 3.色谱条件 (1) Symmetry C18 反相柱:150mm×3.9mm, 5μm。 (2) 流动相:甲醇/蒸馏水(1:1,V/V)。 (3) 流速:1.0ml/min。 (4) 检测波长:210nm。 (5) 灵敏度:0.01AUFS 【计算】 据待测样品峰高值从校正曲线上查出相应浓度或由校正曲线方程求得。 【参考范围】 苯妥英的有效血药浓度范围及有关参数 见表 15-4

表15-4苯妥英有效血药浓度范围及有关参数表有关参数有效血药浓度范围(mg/L)10~20>25潜在中毒浓度(mg/L)常用维持剂量(mg/kg·d)成人5.0儿童5.0~8.0口服吸收率(%)90达峰浓度时间(h)4~8分布容积(L/kg)0.6~0.8消除半寿期(h)随剂量改变在有效血药浓度范围内成人18~30儿童12~22达稳态时间(在有效血药浓度范围内,d)5~14成人儿童2~5 达稳态后采血时间【临床意义】苯妥英是一种常用的抗癫痫药物,但其不良反应多,毒性大,安全范围窄,具有非线性药代动力学的特征,在体内的消除率常数与剂量有依赖关系,其半寿期随剂量的增加而延长,当剂量增加到一定程度时,再稍有增加,即可引起血药浓度很大的变化,苯妥英被认为是最需要进行监测的药物,也是当前国内外监测得最多又最卓有成效的药物当血药浓度超过20mg/L就可能发生毒性症状,20mg/L以上会出现眼球震颤;25~30mg/L时出现共济失调、复视等;40mg/L以上困倦,昏睡等。【注意事项】1.苯妥英为白色无臭粉末,在空气中易潮解,并吸收CO2,析出二苯乙酰脲。所以称量定要快,否则称量结果不准。2.在测定波长的选择上,文献报道有258nm、254nm、240nm、214nm、212nm和210nm8
8 表 15-4 苯妥英有效血药浓度范围及有关参数表 有关参数 有效血药浓度范围(mg/L) 10~20 潜在中毒浓度(mg/L) >25 常用维持剂量(mg/kg·d) 成人 5.0 儿童 5.0~8.0 口服吸收率(%) 90 达峰浓度时间(h) 4~8 分布容积(L/kg) 0.6~0.8 消除半寿期(h) 随剂量改变 在有效血药浓度范围内 成人 18~30 儿童 12~22 达稳态时间(在有效血药浓度范围内, d) 成人 5~14 儿童 2~5 采血时间 达稳态后 【临床意义】 苯妥英是一种常用的抗癫痫药物,但其不良反应多,毒性大,安全范围 窄,具有非线性药代动力学的特征,在体内的消除率常数与剂量有依赖关系,其半寿期随剂 量的增加而延长,当剂量增加到一定程度时,再稍有增加,即可引起血药浓度很大的变化, 苯妥英被认为是最需要进行监测的药物,也是当前国内外监测得最多又最卓有成效的药物。 当血药浓度超过 20mg/L 就可能发生毒性症状,20mg/L 以上会出现眼球震颤;25~30mg/L 时 出现共济失调、复视等;40mg/L 以上困倦,昏睡等。 【注意事项】 1.苯妥英为白色无臭粉末,在空气中易潮解,并吸收 CO2,析出二苯乙酰脲。所以称量 一定要快,否则称量结果不准。 2.在测定波长的选择上,文献报道有 258nm、254nm、240nm、214nm、212nm 和 210nm

等,由于苯妥英在低浓度(5μg/L以下)时吸收值较小,而210nm测定吸收最强,灵敏度高且线性关系较好,故本实验中选择了210nm。其缺陷是对甲醇的纯度要求较高,国内主要厂家生产的HPLC色谱纯甲醇基本上可达到要求。若用分析纯甲醇,需经重蒸,且最好改用波长254nm检测,这样基线会较平稳,但灵敏度较低。3.用甲醇沉淀蛋白直接进样,会有少量蛋白污染分析柱,最好在分析柱前接保护柱,这样可减少分析柱的污染,延长分析柱的寿命。4.在流动相的选择上,甲醇:水为1:1时,内标和苯妥英的保留时间适当,测定时无干扰,而且比较经济。【评价】测定苯妥英的方法有HPLC、FPIA、EMIT和RIA法。HPLC法具有灵敏度高,特异性、重复性、准确性好的特点,被公认为苯妥英药物监测的首选方法。本法测定血清苯妥英的浓度在2~50mg/L的范围呈良好的线性关系(r=0.9997),回收率为96%~98%,CV<4.2%。用甲醇沉淀蛋白直接进样,样品预处理简单、快速,特别适应于临床应用。临床常用的其他抗癫痫药物如苯巴比妥、卡马西平等不干扰测定,常可采用HPLC法同时测定这些抗癫痫药物。实验114HPLC法测定全血环孢素 A【原理】环孢素 A(cyclosporine,CsA)是由11个氨基酸组成的环状多肽,高脂溶性、不溶于酸,微溶于碱。全血标本破碎红细胞后用乙醚把环孢素A提取出来,同时除去蛋白质,再把含有环孢素A的乙醚提取液浓缩,然后用流动相溶解残渣,进样经高效液相色谱柱分离可把环孢素A和其他理化性不同的杂质分开,于波长210nm处检测,外标法定量。【试剂】,100uμg/ml环孢素A标准贮存液精确称取环孢素A(分子量1202)10mg溶于少量的甲醇中,再用甲醇定容至100ml。2.0.025mol/LNaOH溶液。3.0.025mol/LHCI溶液。4.甲醇、乙腈为色谱纯。5.乙醚、正已烷均应重蒸后使用。【操作步骤】一般在清晨服用环孢素A前0.5h采血。取肝素抗凝全血2ml,加1.样品的处理0.025mol/LNaOH溶液2ml,旋转混合30s使其溶血;加入无水乙醚5ml提取2次,乙醚提取9
9 等,由于苯妥英在低浓度(5μg/L 以下)时吸收值较小,而 210nm 测定吸收最强,灵敏度高, 且线性关系较好,故本实验中选择了 210nm。其缺陷是对甲醇的纯度要求较高,国内主要厂 家生产的 HPLC 色谱纯甲醇基本上可达到要求。若用分析纯甲醇,需经重蒸,且最好改用波 长 254nm 检测,这样基线会较平稳,但灵敏度较低。 3.用甲醇沉淀蛋白直接进样,会有少量蛋白污染分析柱,最好在分析柱前接保护柱,这 样可减少分析柱的污染,延长分析柱的寿命。 4.在流动相的选择上,甲醇:水为 1:1 时,内标和苯妥英的保留时间适当,测定时无 干扰,而且比较经济。 【评价】 测定苯妥英的方法有 HPLC、FPIA、EMIT 和 RIA 法。HPLC 法具有灵敏度 高,特异性、重复性、准确性好的特点,被公认为苯妥英药物监测的首选方法。本法测定血 清苯妥英的浓度在 2~50mg/L 的范围呈良好的线性关系(r=0.9997),回收率为 96%~98%,CV <4.2%。用甲醇沉淀蛋白直接进样,样品预处理简单、快速,特别适应于临床应用。临床常 用的其他抗癫痫药物如苯巴比妥、卡马西平等不干扰测定,常可采用 HPLC 法同时测定这些 抗癫痫药物。 实验 114 HPLC 法测定全血环孢素 A 【原理】 环孢素 A(cyclosporine,CsA)是由 11 个氨基酸组成的环状多肽,高脂溶性、 不溶于酸,微溶于碱。全血标本破碎红细胞后用乙醚把环孢素 A 提取出来,同时除去蛋白质, 再把含有环孢素 A 的乙醚提取液浓缩,然后用流动相溶解残渣,进样经高效液相色谱柱分离, 可把环孢素 A 和其他理化性不同的杂质分开,于波长 210nm 处检测,外标法定量。 【试剂】 1.100μg/ml 环孢素 A 标准贮存液 精确称取环孢素 A(分子量 1 202)10mg 溶于少量的 甲醇中, 再用甲醇定容至 100ml。 2.0.025mol/L NaOH 溶液。 3.0.025mol/L HCl 溶液。 4.甲醇、乙腈为色谱纯。 5.乙醚、正已烷均应重蒸后使用。 【操作步骤】 1.样品的处理 一般在清晨服用环孢素 A 前 0.5h 采血。取肝素抗凝全血 2ml,加 0.025mol/L NaOH 溶液 2ml,旋转混合 30s 使其溶血;加入无水乙醚 5ml 提取 2 次,乙醚提取

液在45℃空气下吹干:残渣中加入0.025mol/LHCl和甲醇各2ml,溶解后加入正已烷5ml洗涤2次;在上述水相中加入0.025mol/LNaOH溶液2ml和乙醚4ml提取2次,醚提取液在45℃空气下吹干。残渣用液动相100u1溶解后进样20μ1,按外标法峰高定量。2.校正曲线的制作取试管7支分别加入空白全血2ml,及0,1,2,4,8,16,32u1的环孢素A标准贮存液(各管终浓度为0,50,100,200,400,800,1600ng/ml),按样品预处理法进行,根据峰高与对应的浓度求直线方程。3.色谱条件:(1) Ultraspere CN 色谱分析柱(4.6mmX100mm, 5 μm)。(2)流动相:乙:甲醇:蒸馏水(35:15:50)。(3)流速:1.0ml/min。(4)检测波长:210nm。(5)柱温:55℃。【计算】把待测样品的峰高值代入直线方程求出样品的浓度【参考范围】环孢素A的有效全血药物浓度范围为100~450ng/ml,潜在中毒全血药物浓度为600ng/ml。【临床意义】环孢素A能阻断T细胞(移植的主攻手)的活动而不能影响B细胞,不抑制机体的抗感染能力,因而它是一种选择性高、毒性低的新型强效免疫抑制剂,是一种较理想的抗排异药物,能有效地抑制心、肝、肺、肾、胰等器官和骨髓、角膜等移植物在移植手术后的排异反应,对预防移植器官的排斥反应十分有效,使移植器官存活率明显提高。但环孢素A治疗浓度范围窄,生物利用度个体差异大,药代动力学复杂,其与剂量相关的毒副反应与排异反应不易区别,且影响环孢素A全血浓度的因素较多,涉及吸收、分布、转化、排泄等方面。因此监测环孢素A 临床血药浓度,对临床合理、安全、有效地使用环孢素A具有重要意义。【注意事项】1.环孢素A与红细胞及血浆蛋白结合受温度、红细胞压积、环孢素A的浓度等因素的影响,因此用血清或血浆作为测定标本的测定值不如全血的测定值稳定。肝素化的全血在4℃下放置7天都不会影响测定结果。2.HPLC法测定环孢素A的一个缺陷在于需要一个费时的样品提取过程及柱选择分离技术,因此给大量样品快速发出检测报告带来困难。HPLC法的样品纯化方式有液-液提取,固相提取、炭吸附提取和柱切换HPLC。本实验采用的液-液提取法,即采用乙醚为有机相,提取过程的主要缺点是会把干扰环孢素A层析的脂溶性内源性的血液组分一同提取出来,为解
10 液在 45℃空气下吹干;残渣中加入 0.025mol/L HCl 和甲醇各 2ml,溶解后加入正已烷 5ml 洗 涤 2 次;在上述水相中加入 0.025mol/L NaOH 溶液 2ml 和乙醚 4ml 提取 2 次,醚提取液在 45℃ 空气下吹干。残渣用液动相 100μl 溶解后进样 20μl,按外标法峰高定量。 2.校正曲线的制作 取试管 7 支分别加入空白全血 2ml,及 0,1,2,4,8,16,32μl 的环孢素 A 标准贮存液(各管终浓度为 0,50,100,200,400,800,1 600ng/ml),按样品预 处理法进行,根据峰高与对应的浓度求直线方程。 3.色谱条件: (1) Ultraspere CN 色谱分析柱(4.6mm×100mm,5μm)。 (2) 流动相:乙腈:甲醇:蒸馏水(35:15:50)。 (3) 流速:1.0ml/min。 (4) 检测波长:210nm。 (5) 柱温:55℃。 【计算】 把待测样品的峰高值代入直线方程求出样品的浓度。 【参考范围】 环孢素 A 的有效全血药物浓度范围为 100~450ng/ml,潜在中毒全血药 物浓度为 600ng/ml。 【临床意义】 环孢素 A 能阻断 T 细胞(移植的主攻手)的活动而不能影响 B 细胞,不抑 制机体的抗感染能力,因而它是一种选择性高、毒性低的新型强效免疫抑制剂,是一种较理 想的抗排异药物,能有效地抑制心、肝、肺、肾、胰等器官和骨髓、角膜等移植物在移植手 术后的排异反应,对预防移植器官的排斥反应十分有效,使移植器官存活率明显提高。但环 孢素 A 治疗浓度范围窄,生物利用度个体差异大,药代动力学复杂,其与剂量相关的毒副反 应与排异反应不易区别,且影响环孢素 A 全血浓度的因素较多,涉及吸收、分布、转化、排 泄等方面。因此监测环孢素 A 临床血药浓度,对临床合理、安全、有效地使用环孢素 A 具有 重要意义。 【注意事项】 1.环孢素 A 与红细胞及血浆蛋白结合受温度、红细胞压积、环孢素 A 的浓度等因素的 影响,因此用血清或血浆作为测定标本的测定值不如全血的测定值稳定。肝素化的全血在 4℃ 下放置 7 天都不会影响测定结果。 2.HPLC 法测定环孢素 A 的一个缺陷在于需要一个费时的样品提取过程及柱选择分离技 术,因此给大量样品快速发出检测报告带来困难。HPLC 法的样品纯化方式有液-液提取,固 相提取、炭吸附提取和柱切换 HPLC。本实验采用的液-液提取法,即采用乙醚为有机相,提 取过程的主要缺点是会把干扰环孢素 A 层析的脂溶性内源性的血液组分一同提取出来,为解
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