《临床生物化学》课程教学资源（实验指导）第5章 分子生物学实验技术

第五章分子生物学实验技术实验21大鼠肝组织DNA的提取及其含量测定【原理】DNA以核蛋白形式存在于细胞中，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。DNA的提取方法较多，根据实验用途可简可繁。这里介绍一种经济简便不用蛋白酶K提取真核细胞DNA的方法。在DNA抽提缓冲液中，加入SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离；加入EDTA可抑制DNase活性，减少DNA降解。分离出来的DNA用酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染，最后用无水乙醇沉淀DNA。260m处DNA有最大吸收峰，利用该原理测DNA的A260，可计算其浓度。【试剂】1.生理盐水。2.TE缓冲液(pH8.0)含10mmol/LTris-HC(pH8.0)，1mmol/LEDTA-Na2(pH8.0)，以103.4Kpa高压蒸汽灭菌，4℃贮存。3.10%SDS固体SDS10g，加双蒸水70ml于42℃水浴溶解，用双蒸水定容至100ml。4.Tris-HCI饱和重蒸酚(pH8.0）将市售的苯酚置于65℃水浴中溶解，用空气冷凝管进行重蒸馏，当温度升高至183℃时开始收集于数个棕色瓶中（每瓶约200ml)，存于一20℃可保存数年。使用前取一瓶重蒸酚于室温放置一段时间后，移至65℃水浴融化（冰箱取出后勿立即放入65℃水浴中，以防玻璃炸裂)。融化后加8-羟基喹啉至终浓度为0.1%(w/v)，溶解混匀此时溶液呈黄色，小心将酚倒入分液漏斗中。加入等体积的1mmol/LTris-HCI(pH8.0)，立即加盖，剧烈振荡并加入固体Tris摇匀(一般加1g固体Tris/100ml酚)。静置分层后从分液漏斗中放出下层黄色酚相，弃上层。将酚重新加至分液漏斗中，加入等体积的含0.2%β-巯基乙醇的0.1mol/LTris-HCI(pH8.0)，剧烈振荡，直至酚相pH>7.8，将酚装入棕色试剂瓶中，加入0.1倍酚体积的含0.2%β-巯基乙醇的0.1mol/LTris-HC(pH8.0)覆盖酚相，置4℃贮存备用。由于酚重蒸和平衡费时，操作有一定危险，因此也可直接从试剂公司购买Tris-HCI 饱和重蒸酚。5.氯仿/异戊醇(24:1，v:v）均为分析纯。6.10mol/L醋酸铵。7.无水乙醇(AR)。8.10mg/ml RNaseA称取 RNaseA 10mg 溶于10mmol/L Tris-HC(pH7.5)、15mmol/LNaCI

1 第五章 分子生物学实验技术 实验 21 大鼠肝组织 DNA 的提取及其含量测定 【原理】 DNA 以核蛋白形式存在于细胞中，制备 DNA 的原则是既要将 DNA 与蛋白 质、脂类和糖类等分离，又要保持 DNA 分子的完整。DNA 的提取方法较多，根据实验用途 可简可繁。这里介绍一种经济简便不用蛋白酶 K 提取真核细胞 DNA 的方法。在 DNA 抽提缓 冲液中，加入 SDS 可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与 DNA 分离；加入 EDTA 可抑制 DNase 活性，减少 DNA 降解。分离出来的 DNA 用酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去 DNA 溶液中微量酚的污染，最后用无水乙醇沉淀 DNA。 260nm 处 DNA 有最大吸收峰，利用该原理测 DNA 的 A260，可计算其浓度。 【试剂】 1．生理盐水。 2．TE 缓冲液(pH8.0) 含 10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA-Na2(pH8.0)，以 103.4Kpa 高压蒸汽灭菌，4℃贮存。 3．10% SDS 固体 SDS 10g，加双蒸水 70ml 于 42℃水浴溶解，用双蒸水定容至 100ml。 4．Tris-HCl 饱和重蒸酚(pH8.0) 将市售的苯酚置于 65℃水浴中溶解，用空气冷凝管进 行重蒸馏，当温度升高至 183℃时开始收集于数个棕色瓶中(每瓶约 200ml)，贮存于－20℃可 保存数年。使用前取一瓶重蒸酚于室温放置一段时间后，移至 65℃水浴融化(冰箱取出后勿立 即放入 65℃水浴中，以防玻璃炸裂)。融化后加 8-羟基喹啉至终浓度为 0.1%(w/v)，溶解混匀， 此时溶液呈黄色，小心将酚倒入分液漏斗中。加入等体积的 1mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，立即 加盖，剧烈振荡并加入固体 Tris 摇匀(一般加 1g 固体 Tris/100ml 酚)。静置分层后从分液漏斗 中放出下层黄色酚相，弃上层。将酚重新加至分液漏斗中，加入等体积的含 0.2%β-巯基乙 醇的 0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，剧烈振荡，直至酚相 pH＞7.8，将酚装入棕色试剂瓶中，加入 0.1 倍酚体积的含 0.2%β-巯基乙醇的 0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)覆盖酚相，置 4℃贮存备用。 由于酚重蒸和平衡费时，操作有一定危险，因此也可直接从试剂公司购买 Tris-HCl 饱和 重蒸酚。 5．氯仿/异戊醇(24:1，v:v) 均为分析纯。 6．10 mol/L 醋酸铵。 7．无水乙醇(AR)。 8．10mg/ml RNase A 称取 RNase A 10mg 溶于 10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl

中，于100℃加热煮沸15min灭活DNase，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于一20℃。如为Sigma公司产品，一般则不需加热煮沸【操作步骤】1．迅速处死大鼠，立即取出肝脏约1g，用冷生理盐水洗去附着的血液，滤纸吸干后放入玻璃匀浆器，加入5ml冷TE缓冲液制备匀浆。2.取1ml匀浆液倒入小试管中，加入10%SDS溶液0.1ml，颠倒混匀后，室温10min，溶液变粘稠。3.取饱和酚0.5ml，氯仿：异戊醇(24：1)0.5ml，混合后加入上述溶液中，充分混匀，室温放置10min，其间不断摇动保持溶液呈乳状，3000r/min离心10min。4．小心取出上层水相至小试管中，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，混匀，3000r/min离心5min。5．小心取出上层水相转移到新试管，加入0.3倍水相体积的10mol/L醋酸铵，2.5倍水相体积的无水乙醇充分混匀，纤维状DNA即从溶液中析出。6.用吸管小心取出纤维状DNA，转移到1.5ml离心管，3000r/min，离心5min，小心侄去溶液，用滤纸吸干。7.加1ml蒸馏水和5u1浓度为10mg/ml的RNaseA溶解DNA沉淀，室温放置20min。如DNA难于溶解，可置于56℃水浴20～30min，并不断摇动，直至溶解。8.DNA的含量测定：取0.5mlDNA样品和蒸馏水3.5ml至石英杯中，用蒸馏水调零在752紫外分光光度计上测A260值和A280值。【计算】1.DNA浓度(ug/ml)=A260nm×50×4-0.52.A260mm/A280mm比值【注意事项】1.剧烈振荡可使DNA断裂，因此操作中不能用电动振荡器混匀2．如要得到高纯度DNA，可加入蛋白酶K降解蛋白质。3．根据DNA在260nm处有一吸收峰，而蛋白质在280nm处有一吸收峰的原理，可测定A260m/A280m比值检测DNA的纯度，该比值接近1.8~2.0表示蛋白质污染极少。4．制备重蒸酚和平衡酚过程中应戴手套，防止灼烧皮肤。附：外周血细胞DNA的快速提取2

2 中，于 100℃加热煮沸 15min 灭活 DNase，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于－20℃。如 为 Sigma 公司产品，一般则不需加热煮沸。 【操作步骤】 1．迅速处死大鼠，立即取出肝脏约 1g，用冷生理盐水洗去附着的血液，滤纸吸干后放 入玻璃匀浆器，加入 5ml 冷 TE 缓冲液制备匀浆。 2．取 1ml 匀浆液倒入小试管中，加入 10%SDS 溶液 0.1ml，颠倒混匀后，室温 10min， 溶液变粘稠。 3．取饱和酚 0.5ml，氯仿：异戊醇(24：1)0.5ml，混合后加入上述溶液中，充分混匀，室 温放置 10min，其间不断摇动保持溶液呈乳状，3 000r/min 离心 10min。 4．小心取出上层水相至小试管中，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，混匀，3 000r/min， 离心 5min。 5．小心取出上层水相转移到新试管，加入 0.3 倍水相体积的 10mol/L 醋酸铵，2.5 倍水 相体积的无水乙醇充分混匀，纤维状 DNA 即从溶液中析出。 6．用吸管小心取出纤维状 DNA，转移到 1.5ml 离心管，3 000r/min，离心 5min，小心倒 去溶液，用滤纸吸干。 7．加 1ml 蒸馏水和 5μl 浓度为 10mg/ml 的 RNase A 溶解 DNA 沉淀，室温放置 20min。 如 DNA 难于溶解，可置于 56℃水浴 20～30min，并不断摇动，直至溶解。 8．DNA 的含量测定：取 0.5ml DNA 样品和蒸馏水 3.5ml 至石英杯中，用蒸馏水调零， 在 752 紫外分光光度计上测 A260 值和 A280值。 【计算】 1．DNA 浓度(μg/ml)＝A260nm×50×4÷0.5 2．A260nm/A280nm比值 【注意事项】 1．剧烈振荡可使 DNA 断裂，因此操作中不能用电动振荡器混匀。 2．如要得到高纯度 DNA，可加入蛋白酶 K 降解蛋白质。 3．根据 DNA 在 260nm 处有一吸收峰，而蛋白质在 280nm 处有一吸收峰的原理，可测 定 A260nm/A280nm比值检测 DNA 的纯度，该比值接近 1.8～2.0 表示蛋白质污染极少。 4．制备重蒸酚和平衡酚过程中应戴手套，防止灼烧皮肤。 附：外周血细胞 DNA 的快速提取

【原理】从全血制备白细胞 DNA可用非离子去污剂NP40 和低盐缓冲液直接破裂血中红细胞和白细胞的细胞膜，释出血红蛋白及细胞核，通过离心获得白细胞的细胞核，向核悬液中加入SDS破裂核膜，并使DNA从核蛋白中解离，溶解在一定浓度的NaCI中，经乙醇沉淀即可得到DNA。缓冲液中Mg+的浓度对于获得完整的高分子量DNA十分重要，本实验低盐缓冲液中Mg+浓度是4mmol/L,如超过10mmol/L可导致DNA的降解。缓冲液中的EDTA可抑制DNA的降解【操作步骤】1.取0.5ml外周血置于1.5mlEppendorf(EP)管中，EDTA-Na2抗凝(每管预先加入0.3mo/LEDTA-Naz30ul)，3000r/min离心5min，弃血浆，得沉淀部分。2加0.5m低盐缓冲液(1mml/LTisC7.6m/LCmm/LgC2mm12.5μ1的20%NP40，振荡破碎红细胞，5000r/min离心5min，弃上清。3.用低盐缓冲液洗白细胞2次(每次5000r/min离心5min），弃上清4.加入250ul低盐缓冲液，20ul的10%SDS，混匀，50℃水浴温育10min5.加入100u1饱和NaC(称取4g氯化钠，溶于10ml蒸馏水中即成),剧烈振荡2min,4℃，12000/min离心10min：吸上清于另一干净EP管中，加入1ml预冷的无水乙醇沉淀DNA，12000r/min离心2min，弃上清。7.加1ml预冷的70%乙醇洗涤DNA2次，12000r/min离心2min，弃上清，将EP管倒置于滤纸上，室温干燥。8.加250uITE缓冲液溶解DNA，紫外定量，4℃冰箱保存备用。本实验可在不到 1h内快速提取高质量未降解的全血DNA。实验提取的全血 DNA心存【评价】在室温或37℃温育24h与冻存在一70℃的DNA质量一样，但DNA反复冻融4次以上可导致部分降解本实验可用于提取少至10uI全血样品(可获得340ng左右DNA)或干燥的血液样品，因此本实验适用范围较广。实验22碱裂解法从大肠杆菌中制备质粒DNA从大肠杆菌细胞中分离质粒DNA的方法众多，其分离的依据可根据分子大小不同、碱基组成的差异以及质粒 DNA 的超螺旋共价闭合环状结构的特点进行。目前常用的有碱裂解法(又称碱变性抽提法)、羟基磷灰石柱层析法、质粒DNA释放法、酸酚法、两相法以及溴化乙锭-氯化密度梯度离心法。以上方法各有利弊。但总结多数实验室的实践经验，认为碱裂解法效果良好，经济且收率较高，是一种使用最广泛的制备质粒DNA的方法，也是当今分子生物学研究中的常规方法。制备的质粒DNA可用于酶切、连接、转化以及PCR等【原理】碱裂解分离质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。当细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性，3

3 【原理】 从全血制备白细胞 DNA 可用非离子去污剂 NP40 和低盐缓冲液直接破裂血中红细胞和 白细胞的细胞膜，释出血红蛋白及细胞核，通过离心获得白细胞的细胞核，向核悬液中加入 SDS 破裂核膜， 并使 DNA 从核蛋白中解离，溶解在一定浓度的 NaCl 中，经乙醇沉淀即可得到 DNA。 缓冲液中 Mg 2+的浓度对于获得完整的高分子量 DNA 十分重要，本实验低盐缓冲液中 Mg 2+浓度是 4mmol/L，如超过 10mmol/L 可导致 DNA 的降解。缓冲液中的 EDTA 可抑制 DNA 的降解。 【操作步骤】 1．取 0.5ml 外周血置于 1.5ml Eppendorf(EP)管中，EDTA-Na2 抗凝(每管预先加入 0.3mol/L EDTA-Na2 30μl)，3 000r/min 离心 5min，弃血浆，得沉淀部分。 2．加 0.5ml 低盐缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，pH7.6，10mmol/L KCl，4mmol/L MgCl2，2mmol/L EDTA)， 12.5μl 的 20% NP40，振荡破碎红细胞，5 000r/min 离心 5min，弃上清。 3．用低盐缓冲液洗白细胞 2 次(每次 5 000r/min 离心 5min)，弃上清。 4．加入 250μl 低盐缓冲液，20μl 的 10%SDS，混匀，50℃水浴温育 10min。 5．加入 100μl 饱和 NaCl(称取 4g 氯化钠，溶于 10ml 蒸馏水中即成)，剧烈振荡 2min，4℃，12 000r/min 离心 10min。 6． 吸上清于另一干净 EP 管中，加入 1ml 预冷的无水乙醇沉淀 DNA，12 000r/min 离心 2min，弃 上清。 7．加 1ml 预冷的 70%乙醇洗涤 DNA 2 次，12 000r/min 离心 2min，弃上清，将 EP 管倒置于滤纸上， 室温干燥。 8．加 250μl TE 缓冲液溶解 DNA，紫外定量，4℃冰箱保存备用。 【评价】 本实验可在不到 1h 内快速提取高质量未降解的全血 DNA。实验提取的全血 DNA 贮存 在室温或 37℃温育 24h 与冻存在－70℃的 DNA 质量一样，但 DNA 反复冻融 4 次以上可导致部分降解。 本实验可用于提取少至 10μl 全血样品(可获得 340ng 左右 DNA)或干燥的血液样品，因此本实验适用范围 较广。 实验 22 碱裂解法从大肠杆菌中制备质粒 DNA 从大肠杆菌细胞中分离质粒 DNA 的方法众多，其分离的依据可根据分子大小不同、碱 基组成的差异以及质粒 DNA 的超螺旋共价闭合环状结构的特点进行。目前常用的有碱裂解 法(又称碱变性抽提法)、羟基磷灰石柱层析法、质粒 DNA 释放法、酸酚法、两相法以及溴化 乙锭-氯化铯密度梯度离心法。以上方法各有利弊。但总结多数实验室的实践经验，认为碱裂 解法效果良好，经济且收率较高，是一种使用最广泛的制备质粒 DNA 的方法，也是当今分 子生物学研究中的常规方法。制备的质粒 DNA 可用于酶切、连接、转化以及 PCR 等。 【原理】 碱裂解分离质粒 DNA 是基于染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异 而达到分离的目的。当细胞在 NaOH 和 SDS 溶液中裂解时，蛋白质与染色体 DNA 发生变性

加入醋酸钾中和液，进行离心后，它们随细胞碎片沉淀下来，而变性的质粒DNA又恢复到原来的构型留在上清中，再经酚/氯仿抽提乙醇沉淀等步骤获得质粒DNA质粒DNA的存在形式有3种：①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②开环DNA，此种质粒DNA两条链中有一条发生一处或多处断裂；③线性DNA，因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成。在电泳时同一质粒DNA的3种形式泳动速度：超螺旋>线性>开环。【试剂】1.菌种含pBR322或其他质粒DNA的大肠杆菌工程菌如HB101，DH5α，JM109等如实验后需直接酶切制备的质粒DNA，可选用科研工作中用EcoRI非定向克隆构建的重组质粒DNA转化的大肠杆菌。2.LB液体培养基称取胰蛋白陈3.0g，酵母提取物1.5g，NaCI3.0g，加双蒸水200m溶解，用5mol/LNaOH调至pH7.4，定容至300ml，转移至三角烧瓶中，以103.4Kpa高压灭菌20min。3.10mg/ml氨苄青霉素(Amp)溶液在无菌条件下配制，一20℃贮存备用。4.含Amp的LB固体培养基每100mlLB培养液在临高压灭菌前加入1.5g琼脂，以103.4KPa高压灭菌20min，溶液尚未完全冷却时，即应取出培养基，并轻轻摇动以使琼脂均匀分布于整个培养基中。必须小心，此时培养基溶液可能过热，旋动液体会发生暴沸。应使培养基降温至50℃用手背碰一下瓶壁不致烫手），方可加入Amp，按每100ml培养基加10mg/mlAmp溶液1ml，使其终浓度为100μg/ml，然后在超净台上铺平板，90mm直径的培养血约需25ml培养基。5.Tris-HCI 饱和酚(pH8.0)与TE缓冲液同实验21。6.溶液I含50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na2，25mmol/LTris-HCI(pH8.0)，临用前加溶菌酶至2mg/ml。7. 溶液II含200mmol/LNaOH，10g/LSDS，临用前用两种溶液的贮存液配制8.溶液IⅢl5mol/L醋酸钾溶液60ml(称取29.4g醋酸钾定容至60ml)，冰醋酸11.5ml和双蒸水28.5ml混合而成。9.10mg/mlRNaseA同实验21。10.50×TAE电泳缓冲液取Tris24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mo/LEDTA(pH8.0)20ml加蒸馏水至100ml。1XTAE为配制琼脂糖凝胶及其电泳的应用缓冲液。11.溴酚蓝指示剂溶液(6×上样缓冲液）称取溴酚蓝100mg，加双蒸水5ml，在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后定容至50ml，加入NaOH1滴，调至蓝色。4

4 加入醋酸钾中和液，进行离心后，它们随细胞碎片沉淀下来，而变性的质粒 DNA 又恢复到 原来的构型留在上清中，再经酚/氯仿抽提乙醇沉淀等步骤获得质粒 DNA。 质粒 DNA 的存在形式有 3 种：①共价闭环 DNA，常以超螺旋形式存在；②开环 DNA， 此种质粒 DNA 两条链中有一条发生一处或多处断裂；③线性 DNA，因质粒 DNA 的两条链 在同一处断裂而造成。在电泳时同一质粒 DNA 的 3 种形式泳动速度：超螺旋＞线性＞开环。 【试剂】 1．菌种 含 pBR322 或其他质粒 DNA 的大肠杆菌工程菌如 HB101，DH5α，JM109 等， 如实验后需直接酶切制备的质粒 DNA，可选用科研工作中用 EcoRⅠ非定向克隆构建的重组 质粒 DNA 转化的大肠杆菌。 2．LB 液体培养基 称取胰蛋白胨 3.0g，酵母提取物 1.5g，NaCl 3.0g，加双蒸水 200ml 溶解，用 5mol/L NaOH 调至 pH7.4，定容至 300ml，转移至三角烧瓶中，以 103.4Kpa 高压灭 菌 20min。 3．10mg/ml 氨苄青霉素(Amp)溶液 在无菌条件下配制，－20℃贮存备用。 4．含 Amp 的 LB 固体培养基 每 100ml LB 培养液在临高压灭菌前加入 1.5g 琼脂，以 103.4KPa 高压灭菌 20min，溶液尚未完全冷却时，即应取出培养基，并轻轻摇动以使琼脂均 匀分布于整个培养基中。必须小心，此时培养基溶液可能过热，旋动液体会发生暴沸。应使 培养基降温至 50℃(用手背碰一下瓶壁不致烫手)，方可加入 Amp，按每 100ml 培养基加 10mg/ml Amp 溶液 1ml，使其终浓度为 100μg/ml，然后在超净台上铺平板，90mm 直径的培 养皿约需 25ml 培养基。 5．Tris-HCl 饱和酚(pH8.0)与 TE 缓冲液 同实验 21。 6．溶液Ⅰ 含 50mmol/L 葡萄糖，10mmol/ EDTA-Na2，25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，临用 前加溶菌酶至 2mg/ml。 7．溶液Ⅱ 含 200mmol/L NaOH，10g/L SDS，临用前用两种溶液的贮存液配制。 8．溶液Ⅲ 5mol/L 醋酸钾溶液 60ml(称取 29.4g 醋酸钾定容至 60ml)，冰醋酸 11.5ml 和 双蒸水 28.5ml 混合而成。 9．10mg/ml RNase A 同实验 21。 10．50×TAE 电泳缓冲液 取 Tris24.2g，冰醋酸 5.7ml，0.25mol/L EDTA(pH8.0)20ml， 加蒸馏水至 100ml。1×TAE 为配制琼脂糖凝胶及其电泳的应用缓冲液。 11．溴酚蓝指示剂溶液(6×上样缓冲液) 称取溴酚蓝 100mg，加双蒸水 5ml，在室温下过 夜，待溶解后再称取蔗糖 25g，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后定容至 50ml，加 入 NaOH 1 滴，调至蓝色

12.1mg/ml溴化乙锭(EB）戴手套谨慎称取EB20mg于棕色试剂瓶中，加20ml双蒸水，溶解后贮于4℃备用，配制琼脂糖凝胶时每100ml凝胶加50ulEB。13.DNA分子量标准根据需要购买，一般浓度为0.5ug/ul。13．其他试剂氯仿、异丙醇、无水乙醇、琼脂糖、异戊醇。【操作步骤】1．用接种环挑取1环冷冻保存的含质粒DNA大肠杆菌工程菌，划线接种于含有Amp的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养约12h(过夜)。2.用接种针或消毒牙签挑取单菌落于盛有2ml LB液体培养基(含100uμg/mlAmp)的试管中，37℃摇荡培养过夜。3．将菌液收集在1.5ml的EP管中，10000r/min离心2min，弃上清，将离心管倒置于纸巾上，以使所有液体流出。4.在沉淀中加入溶液1100ul，涡旋混匀，静置5min。5.加入新鲜配制的溶液II200u1，颠倒数次，轻轻混匀，冰浴5~10min(溶液变透明，粘稠)。6．加入溶液IⅢI150μ1，颠倒混匀，冰浴5～10min(溶液出现白色沉淀)。7.12000r/min离心2min，将上清转移至另一EP管中。8.加等体积酚抽提1次，12000r/min离心2min，取上层水相转移至另一EP管。9.加等体积氯仿/异戊醇(24：1，v/v)抽提1次，12000r/min离心2min，取上层水相转移至另一EP管。10.加入2倍体积无水乙醇振荡混匀，于室温放置2min沉淀DNA。12000r/min，离心5min，弃乙醇。11.用70%乙醇洗涤沉淀，12000r/min，离心5min，弃乙醇，室温下静置使乙醇挥发或真空干燥。12.用50u1含RNaseA的TE缓冲液溶解DNA沉淀，振荡，室温放置20min13.制备琼脂糖凝胶按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量，见表5-1。表 5-1 琼脂糖凝胶浓度与分辨DNA 大小范围的关系凝胶中的琼脂糖含量[%(w/v)]线性 DNA 分子的有效分离范围(kb)0.35~600.61~200.7 0.8~105

5 12．1 mg/ml 溴化乙锭(EB) 戴手套谨慎称取 EB 20mg 于棕色试剂瓶中，加 20ml 双蒸 水，溶解后贮于 4℃备用，配制琼脂糖凝胶时每 100ml 凝胶加 50μl EB。 13．DNA 分子量标准 根据需要购买，一般浓度为 0.5μg/μl。 13．其他试剂 氯仿、异丙醇、无水乙醇、琼脂糖、异戊醇。 【操作步骤】 1．用接种环挑取 1 环冷冻保存的含质粒 DNA 大肠杆菌工程菌，划线接种于含有 Amp 的 LB 固体培养基平板上，37℃倒置培养约 12h(过夜)。 2．用接种针或消毒牙签挑取单菌落于盛有 2 ml LB 液体培养基(含 100μg/ml Amp)的试管 中，37℃摇荡培养过夜。 3．将菌液收集在 1.5ml 的 EP 管中，10 000r/min 离心 2min，弃上清，将离心管倒置于一 纸巾上，以使所有液体流出。 4．在沉淀中加入溶液Ⅰ 100μl，涡旋混匀，静置 5min。 5．加入新鲜配制的溶液Ⅱ 200μl，颠倒数次，轻轻混匀，冰浴 5～10min(溶液变透明， 粘稠)。 6．加入溶液Ⅲ150μl，颠倒混匀，冰浴 5～10min(溶液出现白色沉淀)。 7．12 000r/min 离心 2min，将上清转移至另一 EP 管中。 8．加等体积酚抽提 1 次，12 000r/min 离心 2min，取上层水相转移至另一 EP 管。 9．加等体积氯仿/异戊醇(24：1，v/v)抽提 1 次，12 000r/min 离心 2min，取上层水相转移 至另一 EP 管。 10．加入 2 倍体积无水乙醇振荡混匀，于室温放置 2min 沉淀 DNA。12 000r/min，离心 5min，弃乙醇。 11．用 70%乙醇洗涤沉淀，12 000r/min，离心 5min，弃乙醇，室温下静置使乙醇挥发或 真空干燥。 12．用 50μl 含 RNase A 的 TE 缓冲液溶解 DNA 沉淀，振荡，室温放置 20min。 13．制备琼脂糖凝胶 按照被分离 DNA 的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量，见表 5-1。 表 5-1 琼脂糖凝胶浓度与分辨 DNA 大小范围的关系 凝胶中的琼脂糖含量[%(w/v)] 线性 DNA 分子的有效分离范围(kb) 0.3 5～60 0.6 1～20 0.7 0.8～10

0.90.5 ~71.2 0.4~61.5 0.2~32.00.1 ~2称取0.8g琼脂糖倒入三角瓶中，加入1XTAE缓冲液100ml，置微波炉或水浴加热至完全熔化，取出摇匀，稍冷却后加50uIEB染色液，摇匀。14.灌胶(1）取洁净的电泳内槽(又称托盘)，用橡皮膏或透明胶带将内槽的两端边缘封好(一定要封严，不能留缝隙)。(2）将内槽放置于一水平台面，并插好所需齿数和厚度的样品梳子。(3）将冷却至60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓慢倒入内槽，直至所需厚度，注意不要形成气泡，特别是梳子下，如有气泡可用牙签挑破(4）待胶凝固后，小心取出梳子，撕去橡皮膏或透明胶带，将带凝胶的内槽放入电泳槽中，注意凝胶点样端要靠近负极。(5）加入1XTAE缓冲液至电泳槽，缓冲液刚没过凝胶表面即可。15.加样剪取适当大小的蜡膜(Parafilm膜)，取6×上样缓冲液1u1点于膜上数点，取5uI质粒DNA和2u1DNA分子标准(约1ug)分别与上样缓冲液混匀，将其分别加入凝胶的点样孔（记录点样顺序及点样量）。16．电泳接通电源槽与电泳仪的电源(检查正负极，DNA片段是从负极向正极移动)。DNA的迁移率与电压成正比，电压不超过5V/cm凝胶长度。当溴酚蓝染料移动至凝胶前沿12cm处，切断电源，停止电泳。17.观察结果取出内槽，在紫外分析仪的玻璃平板上小心推出凝胶，通过防护屏或戴防护眼镜观察紫外灯透射的结果，DNA存在处应显出桔红色荧光条带，一般可观察到2种或3种质粒形式。【注意事项】1.应先在实验前2天划线接种细菌，实验前1天晚上进行单菌落液体培养，并注意无菌操作。2.加入溶液I时可用力振荡，而加入溶液II5min后，如溶液不变粘稠（用移液嘴沾吸没有丝状物出现)，则应终止实验。检查使用的试剂是否正确，加量是否正确。3．溶液I中的溶菌酶宜临用前加入。溶液I也应临用前用母液配制

6 0.9 0.5～7 1.2 0.4～6 1.5 0.2～3 2.0 0.1～2 称取 0.8g 琼脂糖倒入三角瓶中，加入 1×TAE 缓冲液 100ml，置微波炉或水浴加热至完 全熔化，取出摇匀，稍冷却后加 50μl EB 染色液，摇匀。 14．灌胶 (1) 取洁净的电泳内槽(又称托盘)，用橡皮膏或透明胶带将内槽的两端边缘封好(一定要 封严，不能留缝隙)。 (2) 将内槽放置于一水平台面，并插好所需齿数和厚度的样品梳子。 (3) 将冷却至 60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓慢倒入内槽，直至所需厚度，注意不要形成 气泡，特别是梳子下，如有气泡可用牙签挑破。 (4) 待胶凝固后，小心取出梳子，撕去橡皮膏或透明胶带，将带凝胶的内槽放入电泳槽 中，注意凝胶点样端要靠近负极。 (5) 加入 1×TAE 缓冲液至电泳槽，缓冲液刚没过凝胶表面即可。 15．加样 剪取适当大小的蜡膜(Parafilm 膜)，取 6×上样缓冲液 1μl 点于膜上数点，取 5μl 质粒 DNA 和 2μl DNA 分子标准(约 1μg)分别与上样缓冲液混匀，将其分别加入凝胶的 点样孔(记录点样顺序及点样量)。 16．电泳 接通电源槽与电泳仪的电源(检查正负极，DNA 片段是从负极向正极移动)。 DNA 的迁移率与电压成正比，电压不超过 5V/cm凝胶长度。当溴酚蓝染料移动至凝胶前沿 1～ 2cm 处，切断电源，停止电泳。 17．观察结果 取出内槽，在紫外分析仪的玻璃平板上小心推出凝胶，通过防护屏或戴 防护眼镜观察紫外灯透射的结果，DNA 存在处应显出桔红色荧光条带，一般可观察到 2 种或 3 种质粒形式。 【注意事项】 1．应先在实验前 2 天划线接种细菌，实验前 1 天晚上进行单菌落液体培养，并注意无菌 操作。 2．加入溶液Ⅰ时可用力振荡，而加入溶液Ⅱ5min 后，如溶液不变粘稠(用移液嘴沾吸没 有丝状物出现)，则应终止实验。检查使用的试剂是否正确，加量是否正确。 3．溶液Ⅰ中的溶菌酶宜临用前加入。溶液Ⅱ也应临用前用母液配制

4.琼脂糖凝胶的配制可安排在真空干燥和RNaseA处理的实验间隙，为便于电泳后直接可观察结果，EB可在琼脂糖加热熔化至灌胶前加入。因此整个电泳过程均应戴手套操作5.EB是DNA的诱变剂，亦是极强的致癌物，配制和使用过程中要小心，操作时一定要戴手套，用过的手套要及时把手套顺手翻过来，让污染有EB的面朝里，有EB的废液和器皿要分别处理好。附：一步法提取质粒DNA小规模快速制备质粒DNA是筛选大批重组质粒的阳性克隆的一个不可缺少的步骤，常规经典的方法是碱裂解法。通过该方法制备出来的质粒DNA既可进行琼脂糖凝胶电泳，也可进行限制性酶切分析。但该方法在一次筛选数十个克隆时就显得操作步骤烦琐，费时较多。这里介绍一种经本人改良的简便快速的质粒DNA制备方法[见：刘新光，刘文，梁念慈。一种快速可靠的小量制备质粒DNA的方法。基础医学与临床，1998，18(5)；396，可作为今后科研中大量筛选时使用。本方法较经典的碱裂解法省去了碱裂解和乙醇沉淀与洗涤步骤，直接用酚/氯仿一步抽提，十分简单实用【操作步骤】1.收获1.5ml过夜培养菌液于1.5mlEP管中，在12000r/min离心10s。2.弃去培养液并尽量吸干(使用微量台式真空泵较方便)，加入50u1TE缓冲液(pH8.0)，用涡旋混合器振荡以悬浮细胞3.用1ml玻璃刻量吸量管吸取酚/氯仿(1:1)混合液1ml，每个EP管加入50ul，在涡旋混合器上振荡10s后，以12000r/min离心5min。4.小心取出40uI上清至另一个1.5mlEP管中，加入RNaseA至终浓度50ug/ml，室温放置5min。5.取5u1质粒溶液(与1uI6×上样缓冲液混合)进行0.6%~1%琼脂糖凝胶电泳，并以空载体DNA作对照，根据电泳结果即可判断有无外源DNA插入6．取适当量可能含重组载体的质粒溶液进行限制性酶切分析。实验23PCR扩增目的DNA【原理】聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)类似于DNA的天然复制过程，是一种体外扩增特异性DNA的技术。PCR是在模板DNA、两条寡核苷酸引物和4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)存在的条件下，耐热的 Taq DNA聚合酶催化的酶促反应。PCR反应的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分3步：①变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。②退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在

7 4．琼脂糖凝胶的配制可安排在真空干燥和 RNase A 处理的实验间隙，为便于电泳后直接 可观察结果，EB 可在琼脂糖加热熔化至灌胶前加入。因此整个电泳过程均应戴手套操作。 5．EB 是 DNA 的诱变剂，亦是极强的致癌物，配制和使用过程中要小心，操作时一定要 戴手套，用过的手套要及时把手套顺手翻过来，让污染有 EB 的面朝里，有 EB 的废液和器皿 要分别处理好。 附：一步法提取质粒 DNA 小规模快速制备质粒 DNA 是筛选大批重组质粒的阳性克隆的一个不可缺少的步骤，常规经典的方法 是碱裂解法。通过该方法制备出来的质粒 DNA 既可进行琼脂糖凝胶电泳，也可进行限制性酶切分析。但 该方法在一次筛选数十个克隆时就显得操作步骤烦琐，费时较多。 这里介绍一种经本人改良的简便快速的质粒 DNA 制备方法[见：刘新光，刘文，梁念慈. 一种快速可 靠的小量制备质粒 DNA 的方法. 基础医学与临床，1998，18(5)：396]，可作为今后科研中大量筛选时使 用。本方法较经典的碱裂解法省去了碱裂解和乙醇沉淀与洗涤步骤，直接用酚/氯仿一步抽提，十分简单实 用。 【操作步骤】 1．收获 1.5ml 过夜培养菌液于 1.5ml EP 管中，在 12 000r/min 离心 10s。 2．弃去培养液并尽量吸干(使用微量台式真空泵较方便)，加入 50μl TE 缓冲液(pH8.0)，用涡旋混合 器振荡以悬浮细胞。 3．用 1ml 玻璃刻量吸量管吸取酚/氯仿(1:1)混合液 1ml，每个 EP 管加入 50μl，在涡旋混合器上振荡 10s 后，以 12 000r/min 离心 5min。 4．小心取出 40μl 上清至另一个 1.5ml EP 管中，加入 RNase A 至终浓度 50μg/ml，室温放置 5min。 5．取 5μl 质粒溶液(与 1μl 6×上样缓冲液混合)进行 0.6%～1%琼脂糖凝胶电泳，并以空载体 DNA 作对照，根据电泳结果即可判断有无外源 DNA 插入。 6．取适当量可能含重组载体的质粒溶液进行限制性酶切分析。 实验 23 PCR 扩增目的 DNA 【原理】 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)类似于 DNA 的天然复制过 程，是一种体外扩增特异性 DNA 的技术。PCR 是在模板 DNA、两条寡核苷酸引物和 4 种脱 氧核苷三磷酸(dNTP)存在的条件下，耐热的 Taq DNA 聚合酶催化的酶促反应。PCR 反应的特 异性取决于引物和模板 DNA 结合的特异性。反应分 3 步：①变性：通过加热使 DNA 双螺旋 的氢键断裂，双链解离形成单链 DNA。②退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引 物要复杂得多，而且反应体系中引物 DNA 量大大多于模板 DNA，使引物和其互补的模板在

局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。③延伸：TagDNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应，以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段可大量复制，数量可达2X106~7拷贝。本实验不设计特定引物，各实验室可充分利用科研用不完的引物开展本实验。一旦一对引物序列确定，PCR扩增长度也就确定。【试剂】、TagDNA聚合酶国产或进口酶，浓度为5U/u1，均配有相应的缓冲液和MgCh2。2.10×扩增缓冲液含500mmol/LKCl，100mmol/LTris-HCI(pH9.0于室温），1%TritonX-100.3．25mmol/LMgCl2此为应用液浓度的10倍，配套供应。4.dNTP为4种脱氧核苷三磷酸的混合液，有商品出售，一般浓度为各2.5或10mmol/L。上游引物或下游引物引物的正确设计是PCR反应成功扩增的一个关键条件，必须遵循一定的原则，最好在引物设计时有计算机辅助分析。设计好后国内有关公司可代理合成按要求用灭菌三蒸水或去离子水溶解配制成25umol/L，分装，一20℃冻存备用。6.DNA模板实验21提取的大鼠组织 DNA或人白细胞基因组 DNA(配成约1ug/uI浓度)；或纯化的重组质粒DNA(配成2ng/uI)。7.灭菌轻矿物油或石蜡油：视PCR仪器的型号决定是否需要。8.琼脂糖凝胶电泳所需试剂(琼脂糖、电泳缓冲液和上样缓冲液)：见实验22。9.DNA分子量标准：国产或进口产品，可根据扩增带的大小选择。【操作步骤】1.按以下顺序，用微量移液器将各成分分别加入在0.2ml或0.5ml灭菌薄壁离心管中。试剂加样量最终浓度10X扩增缓冲液5μl1X扩增缓冲液5ul25mmol/LMgCl22.5mmol/L4或1叫10.2mmol/LdNTP2.5或10mmol/LdNTP25μmo/L上游引物1μl25pmol(0.5 μmol/L)25μmol/L下游引物1 μl25pmol(0.5 μmol/L)5ul基因组DNA或质粒DNA5ug或10ng0.2 μ11UTag DNA聚合酶灭菌三蒸水29 μ1或 32 μ100

8 局部形成杂交链，而模板 DNA 双链之间互补的机会较少。③延伸：Taq DNA 聚合酶催化以 引物为起始点的 DNA 链延伸反应，以上 3 步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个 循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性 DNA 片段可大量复制，数量可达 2 ×106～7 拷贝。 本实验不设计特定引物，各实验室可充分利用科研用不完的引物开展本实验。一旦一对 引物序列确定，PCR 扩增长度也就确定。 【试剂】 1．Taq DNA 聚合酶 国产或进口酶，浓度为 5 U/μl，均配有相应的缓冲液和 MgCl2。 2．10×扩增缓冲液 含 500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-HCl(pH9.0 于室温)，1% Triton X-100。 3．25mmol/L MgCl2 此为应用液浓度的 10 倍，配套供应。 4．dNTP 为 4 种脱氧核苷三磷酸的混合液，有商品出售，一般浓度为各 2.5 或 10mmol/L。 5．上游引物或下游引物 引物的正确设计是 PCR 反应成功扩增的一个关键条件，必须 遵循一定的原则，最好在引物设计时有计算机辅助分析。设计好后国内有关公司可代理合成， 按要求用灭菌三蒸水或去离子水溶解配制成 25μmol/L，分装，－20℃冻存备用。 6．DNA 模板 实验 21 提取的大鼠组织 DNA 或人白细胞基因组 DNA(配成约 1μg/μl 浓度)；或纯化的重组质粒 DNA(配成 2ng/μl)。 7．灭菌轻矿物油或石蜡油：视 PCR 仪器的型号决定是否需要。 8．琼脂糖凝胶电泳所需试剂(琼脂糖、电泳缓冲液和上样缓冲液)：见实验 22。 9．DNA 分子量标准：国产或进口产品，可根据扩增带的大小选择。 【操作步骤】 1．按以下顺序，用微量移液器将各成分分别加入在 0.2ml 或 0.5ml 灭菌薄壁离心管中。 试剂 加样量 最终浓度 10×扩增缓冲液 5μl 1×扩增缓冲液 25mmol/LMgCl2 5μl 2.5mmol/L 2.5 或 10mmol/LdNTP 4 或 1μl 0.2mmol/LdNTP 25μmol/L 上游引物 1μl 25pmol(0.5μmol/L) 25μmol/L 下游引物 1μl 25pmol(0.5μmol/L) 基因组 DNA 或质粒 DNA 5μl 5μg 或 10ng Taq DNA 聚合酶 0.2μl 1U 灭菌三蒸水 29μl 或 32μl

反应总体积50 μl加盖，用手指轻弹离心管底部，使溶液混匀，在台式离心机中离心2秒以集中溶液于管底，加灭菌轻矿物油或石蜡油50u1封住溶液表面，防止溶液的蒸发（如是2400，9600或9700型PCR仪则不需加)。2.视预实验的条件，按以下参数在PCR仪上进行扩增25~35个循环。一般PCR反应的参数为：94℃变性1min;55℃退火1min;72℃延伸1min；其中第1个循环94℃变性5min℃，最后一个循环72℃延伸10min。3.取5uIPCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察有否有预定大小的DNA片段。【注意事项】由于PCR具有超敏感性的特点，极微量的污染便可导致假阳性结果。污染可能来自样品污染、扩增试剂仪器污染和扩增产物交叉污染等。其主要预防措施有：1.工作区隔离分样品处理区和PCR扩增分析区。2.试剂取样及分装要用绝对安全无污染的器皿；对于大包装的试剂用前应分成小包装3.注意实验操作①操作时要戴手套，如有污染要及时更换；②离心管每次开盖前要离心片刻，开盖要小心，防止液体溅出；③常用预混试剂应先加试剂，后加DNA模板；吸每种试剂均要换移液嘴(tip)，在临床检测实验室中吸试剂用的移液器还要与吸DNA 模板的移液器要分开。4.在临床检测时每次PCR均同时设阳性对照、阴性对照和弱阳性对照。5.污染处理①稀酸处理法：常用稀酸处理含有扩增产物的离心管，琼脂糖凝胶和电泳槽及电泳托盘等；②紫外线照射PCR工作室，特别是电泳槽、电泳托盘、离心机、冰盒、移液器等。实验24DNA限制性图谱的绘制-DNA的限制性内切酶酶切分析【原理】限制性内切酶(restriction endonuclease，RE)是由细菌自己产生的能识别双链DNA分子中的特定碱基顺序，并以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键的核酸水解酶。它可分为三种类型：I、II和I型，II型酶就是通常所指的RE，能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割。它是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶，被誉为分子生物学家的手术刀。临床上某些遗传病是由于基因的缺失或插入或突变所致，可造成RE酶切位点

9 反应总体积 50μl 加盖，用手指轻弹离心管底部，使溶液混匀，在台式离心机中离心 2 秒以集中溶液于管 底，加灭菌轻矿物油或石蜡油 50μl 封住溶液表面，防止溶液的蒸发(如是 2400，9600 或 9700 型 PCR 仪则不需加)。 2．视预实验的条件，按以下参数在 PCR 仪上进行扩增 25～35 个循环。一般 PCR 反应的 参数为：94℃变性 1min; 55℃退火 1min; 72℃延伸 1min; 其中第 1 个循环 94℃变性 5min℃， 最后一个循环 72℃延伸 10min。 3．取 5μl PCR 产物进行 0.8%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察有否有预定大小的 DNA 片段。 【注意事项】 由于 PCR 具有超敏感性的特点，极微量的污染便可导致假阳性结果。污 染可能来自样品污染、扩增试剂仪器污染和扩增产物交叉污染等。其主要预防措施有： 1．工作区隔离 分样品处理区和 PCR 扩增分析区。 2．试剂取样及分装 要用绝对安全无污染的器皿；对于大包装的试剂用前应分成小包装。 3．注意实验操作 ①操作时要戴手套，如有污染要及时更换；②离心管每次开盖前要离 心片刻，开盖要小心，防止液体溅出；③常用预混试剂应先加试剂，后加 DNA 模板；④吸 每种试剂均要换移液嘴(tip)，在临床检测实验室中吸试剂用的移液器还要与吸 DNA 模板的移 液器要分开。 4．在临床检测时每次 PCR 均同时设阳性对照、阴性对照和弱阳性对照。 5．污染处理 ①稀酸处理法：常用稀酸处理含有扩增产物的离心管，琼脂糖凝胶和电泳 槽及电泳托盘等；②紫外线照射 PCR 工作室，特别是电泳槽、电泳托盘、离心机、冰盒、移 液器等。 实验 24 DNA 限制性图谱的绘制 -DNA 的限制性内切酶酶切分析 【原理】 限制性内切酶(restriction endonuclease，RE)是由细菌自己产生的能识别双链 DNA 分子中的特定碱基顺序，并以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键的核酸水解酶。它可分 为三种类型：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，Ⅱ型酶就是通常所指的 RE，能识别双链 DNA 的特异顺序，并 在这个顺序内进行切割。它是基因工程中剪切 DNA 分子的常用工具酶，被誉为分子生物学 家的手术刀。临床上某些遗传病是由于基因的缺失或插入或突变所致，可造成 RE 酶切位点

的改变，故当用一定的RE切割时，其切开的片段(分子量)大小与正常人发生差异，即DNA限制性图谱发生改变，据此可达到基因诊断的目的本实验选用价格低廉、酶切效果好的EcoRI(识别位点G+AATTC)对入DNA进行酶切观察RE的特定切割作用及其限制性图谱，理论上可产生分子量分别为21226bp，7421bp，5804bp，5604bp，4878bp和3530bp片段。或选用实验22制备的EcoRI非定向克隆构建的重组质粒DNA作为EcoRI酶切底物，产生载体与插入片段2个片段【试剂】入DNA、实验21制备的基因组 DNA或实验22制备的 EcoRI非定向克隆构建的重组质粒DNA。2.DNA分子量标准。3．限制性内切酶EcoRI及其缓冲液(只需购买国内试剂公司的产品即可，每种RE均配有2种缓冲液，在配套的缓冲液中该RE均可获得 100%酶切活性)。：电泳缓冲液、琼脂糖、溴酚蓝指示剂及EB同实验22。X【操作步骤】1.将下列试剂缓冲液2 u1，入DNA(5ug)或基因组 DNA(5ug)或质粒DNA样品(1 ug)，EcoRI5~10U加至0.5mlEP管中，加双蒸水至20u1，加盖，混匀后稍离心，37℃水浴反应1h。2.取5u1酶切后的样品，0.5~1ug未酶切入DNA或基因组DNA或质粒DNA，DNA分子量标准(均要与上样缓冲液混合)进行0.8%的琼脂糖凝胶电泳(EB已预先加入琼脂糖凝胶中)，在紫外检测仪上观察结果。3.在镜头前加一块红色滤光片，使用100°黑白胶卷，利用透射紫外光作光源，光圈2.8，曝光0.5～2s，调准焦距，可拍摄质量较好的凝胶照片。有条件则使用DNA一次成像仪。【注意事项及评价】1.进行DNA酶切时，要在其最适温度下(大多数为37℃)进行。最好是用每一种酶的专用缓冲液，以达到最佳酶切效率。如遇2种酶酶切应先用低盐缓冲液后用高盐缓冲液，或一种酶切结束后加TE至400ul，再进行酚/氯仿抽提、乙醇沉淀，重新建立第二个酶切反应体系。2.RE一定要在低温(一20℃)下贮存，因含50%甘油，在此温度下一般不会结冰，如结冰则表明冰箱温度低于一20℃，应避免结冰。新购的大包装酶，应先分装。每次吸取后均应将RE管放在冰盒内，用完后立即放在一20℃，每次取酶尽可能使用新的灭菌tip，避免污染3.进行大量酶切时，先要确定RE的浓度。一般1URE于37℃条件下作用底物DNA1h以上可切割1ugDNA。一般来说，要用2~3倍才能保证完全消化，对基因组DNA尤其如10

10 的改变，故当用一定的 RE 切割时，其切开的片段(分子量)大小与正常人发生差异，即 DNA 限制性图谱发生改变，据此可达到基因诊断的目的。 本实验选用价格低廉、酶切效果好的 EcoRⅠ(识别位点 G↓AATTC)对λDNA 进行酶切， 观察 RE 的特定切割作用及其限制性图谱，理论上可产生分子量分别为 21 226bp，7 421bp，5 804bp，5 604bp，4 878bp 和 3 530bp 片段。或选用实验 22 制备的 EcoRⅠ非定向克隆构建的 重组质粒 DNA 作为 EcoRⅠ酶切底物，产生载体与插入片段 2 个片段。 【试剂】 1．λDNA、实验 21 制备的基因组 DNA 或实验 22 制备的 EcoRⅠ非定向克隆构建的重 组质粒 DNA。 2．DNA 分子量标准。 3．限制性内切酶 EcoRⅠ及其缓冲液(只需购买国内试剂公司的产品即可，每种 RE 均配 有 2 种缓冲液，在配套的缓冲液中该 RE 均可获得 100%酶切活性)。 4．电泳缓冲液、琼脂糖、溴酚蓝指示剂及 EB 同实验 22。 【操作步骤】 1．将下列试剂 缓冲液 2μl，λDNA(5μg)或基因组 DNA(5μg)或质粒 DNA 样品(1μ g)，EcoRⅠ5～10U 加至 0.5ml EP 管中，加双蒸水至 20μl ，加盖，混匀后稍离心，37℃水 浴反应 1h。 2．取 5μl 酶切后的样品，0.5～1μg 未酶切λDNA 或基因组 DNA 或质粒 DNA，DNA 分子量标准(均要与上样缓冲液混合)进行 0.8%的琼脂糖凝胶电泳(EB 已预先加入琼脂糖凝胶 中)，在紫外检测仪上观察结果。 3．在镜头前加一块红色滤光片，使用 100º黑白胶卷，利用透射紫外光作光源，光圈 2.8， 曝光 0.5～2s，调准焦距，可拍摄质量较好的凝胶照片。有条件则使用 DNA 一次成像仪。 【注意事项及评价】 1．进行 DNA 酶切时，要在其最适温度下(大多数为 37℃)进行。最好是用每一种酶的专 用缓冲液，以达到最佳酶切效率。如遇 2 种酶酶切应先用低盐缓冲液后用高盐缓冲液，或一 种酶切结束后加 TE 至 400μl，再进行酚/氯仿抽提、乙醇沉淀，重新建立第二个酶切反应体系。 2．RE 一定要在低温(－20℃)下贮存，因含 50%甘油，在此温度下一般不会结冰，如结冰 则表明冰箱温度低于－20℃，应避免结冰。新购的大包装酶，应先分装。每次吸取后均应将 RE 管放在冰盒内，用完后立即放在－20℃，每次取酶尽可能使用新的灭菌 tip，避免污染。 3．进行大量酶切时，先要确定 RE 的浓度。一般 1U RE 于 37℃条件下作用底物 DNA 1h 以上可切割 1μg DNA。一般来说，要用 2～3 倍才能保证完全消化，对基因组 DNA 尤其如