南京师范大学：《微生物学》课程PPT教学课件（实验指导）实验十 细菌的凝集反应

实验十细菌的凝集反应 何伟06一04

实验十 细菌的凝集反应 何伟 06－04

实验目的 #了解血清学方法的原理 #血清学方法在微生物诊断中的作用 #学会利用血清稀释法测定免疫血清的效 价

实验目的 了解血清学方法的原理 血清学方法在微生物诊断中的作用 学会利用血清稀释法测定免疫血清的效 价

实验原理 #颗粒性抗原（如细菌或红血球）的悬液与含有特 异性抗体的血清混合，在适量电解质存在的情 况下，经过一定时间，出现肉眼可见的凝集块 称为凝集反应。参加反应的抗原称凝集原，其 血清中的抗体，称为凝集素。凝集反应的机制 是由于抗原与其相应抗体间存在着相对应的极 性基。极性基的相互吸附，使抗原外周的水化 膜除去，由亲水溶胶变成憎水溶胶。由于电解 质具有降低电位的作用，使抗原颗粒间的排斥 力消除，从而产生了凝集现象。进行细菌的抗 原分析、鉴定及分型，也可应用已知细菌检查 未知血清的抗体

实验原理 颗粒性抗原(如细菌或红血球)的悬液与含有特 异性抗体的血清混合，在适量电解质存在的情 况下，经过一定时间，出现肉眼可见的凝集块， 称为凝集反应。参加反应的抗原称凝集原，其 血清中的抗体，称为凝集素。凝集反应的机制 是由于抗原与其相应抗体间存在着相对应的极 性基。极性基的相互吸附，使抗原外周的水化 膜除去，由亲水溶胶变成憎水溶胶。由于电解 质具有降低电位的作用，使抗原颗粒间的排斥 力消除，从而产生了凝集现象。进行细菌的抗 原分析、鉴定及分型，也可应用已知细菌检查 未知血清的抗体

其 有些细菌即使用生化反应很难区别，但其细菌抗 原成份（包括菌体抗原、鞭毛抗原)却不同。利 用已知的特异抗体测定有无相应的细菌抗原可以 确定菌种或菌型。常用的方法为玻片凝集反应 用己知的特异免疫血清与待鉴定的细菌在玻片上 做凝集反应，如出现凝集菌团侧为阳性，说明该 菌有相应的特异抗原。检测抗原的另一优点为在 应用了抗生素治疗后，细菌生长被抑制，利用培 养方法不能检出的细菌，因尚有抗原存在，在短 期内仍可被检出，从而有助于明确病因。个别情 况下还可利用噬菌体对细菌抗原型别分析，用于 流行病学追踪调查

有些细菌即使用生化反应很难区别，但其细菌抗 原成份（包括菌体抗原、鞭毛抗原）却不同。利 用已知的特异抗体测定有无相应的细菌抗原可以 确定菌种或菌型。常用的方法为玻片凝集反应， 用已知的特异免疫血清与待鉴定的细菌在玻片上 做凝集反应，如出现凝集菌团则为阳性，说明该 菌有相应的特异抗原。检测抗原的另一优点为在 应用了抗生素治疗后，细菌生长被抑制，利用培 养方法不能检出的细菌，因尚有抗原存在，在短 期内仍可被检出，从而有助于明确病因。个别情 况下还可利用噬菌体对细菌抗原型别分析，用于 流行病学追踪调查

实验材料 #大肠杆菌斜面培养物，大肠杆菌悬液（含 10×109个/ml大肠杆菌的生理盐水悬液， 并经60℃加热1h灭活)。 #大肠杆菌免疫抗血清。 #生理盐水、载片、小试管、试管架、移 液管(1ml刻度、5ml)、水浴锅

实验材料 大肠杆菌斜面培养物，大肠杆菌悬液(含 10×109个／ml大肠杆菌的生理盐水悬液， 并经60℃加热l h灭活)。 大肠杆菌免疫抗血清。 生理盐水、载片、小试管、试管架、移 液管（1m1刻度、5ml）、水浴锅

实验步骤 #玻片凝集反应 (1)取洁净干燥的载片一片，用笔划分两区，一端 注明为试验，一端注明为对照。 (2)用接种环取生理盐水，置二滴于对照中心：同 法滴大肠杆菌免疫血清于试验中心。 (3)用接种环取少量大肠杆菌培养物分别研磨乳化 于盐水及血清内，并均匀混合。 (4)将玻片赂为反复摆动后静置于50℃恒温水浴 表面上保温5~10min。 (⑤)观察是否有凝集块出现，如有则记为阳性，没 有则记为阴性

实验步骤 玻片凝集反应 (1)取洁净干燥的载片一片，用笔划分两区，一端 注明为试验，一端注明为对照。 (2)用接种环取生理盐水，置二滴于对照中心；同 法滴大肠杆菌免疫血清于试验中心。 (3)用接种环取少量大肠杆菌培养物分别研磨乳化 于盐水及血清内，并均匀混合。 (4)将玻片赂为反复摆动后静置于50 ℃恒温水浴 表面上保温5～10 min。 (5)观察是否有凝集块出现，如有则记为阳性，没 有则记为阴性

试管凝集反应 #此法为免疫血清定量测定效价法。 (1)取清洁干燥的小试管10支，排列在试管架上。 (2)用移液管加入生理盐水0.5m1于各试管中。 3)取免疫血清0.5m1加入另一试管，并加4.5ml生理盐 水混合，制成稀释1：10的免疫血清。 (4)用移报管吸取斜面培养18h的大肠杆菌培养物、稀 释1：10的免疫血清0.5m1,注入第一管，并吸吹三次 混匀；然后由依次吸取0.5ml注入第二管、第二管到第 三管.如此类推到第九管为止。从第九管吸出 o.5m1弃去，第十管不加血清，以作对照

试管凝集反应 此法为免疫血清定量测定效价法。 (1)取清洁干燥的小试管10支，排列在试管架上。 (2)用移液管加入生理盐水0.5m1于各试管中。 (3)取免疫血清0.5m1加入另一试管，并加4.5ml生理盐 水混合，制成稀释1:10的免疫血清。 (4)用移报管吸取斜面培养18h的大肠杆菌培养物、稀 释1：10的免疫血清0.5m1，注入第一管，并吸吹三次 混匀；然后由依次吸取0.5m1注入第二管、第二管到第 三管.如此类推到第九管为止。从第九管吸出 o．5m1弃去，第十管不加血清，以作对照

#(5)在每管中加入0.5m1经处理的大肠杆菌 菌悬液，作为抗原。摇匀，并置45℃水浴 中2h后，初步观察结果，转置冰箱，次日 再观察结果。观察结果时勿摇动试管 试 管 1 2 3 4 5 6 ? 8 9 10 生理盐水/ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 05 0.5 0.5 0.5 加1：10血清 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 (稀释)注 入第一管 血清的稀释度1：20 1:40 1:801:160 1:320 1:640 1:12801+25601:5120 0 细菌悬液/ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 最后血清 稀释度 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:25601:51201:10240 0 结果

(5)在每管中加入0.5m1经处理的大肠杆菌 菌悬液，作为抗原。摇匀，并置45℃水浴 中2h后，初步观察结果，转置冰箱，次日 再观察结果。观察结果时勿摇动试管

实验结果 #观察管底是否有凝集现象。记录结果 ①完全凝集，凝集块完全沉于管底，液体 澄清，以“十十十十”记录。 ②凝集块沉于管底，液体稍混，以“十十 干”记录。 ③部分凝集，液体混浊，以“十十”记录。 ④极少凝集.液体混浊.以“十”记录。 ⑤无变化记以“一”* #取“十十”的稀释度作为免疫血清的效价

实验结果 观察管底是否有凝集现象。记录结果 ①完全凝集，凝集块完全沉于管底，液体 澄清，以“十十十十”记录。 ②凝集块沉于管底，液体稍混，以“十十 十”记录。 ③部分凝集，液体混浊，以“十十”记录。 ④极少凝集．液体混浊．以“十”记录。 ⑤无变化记以“一”* 取“十十”的稀释度作为免疫血清的效价

问题与讨论 #(一)凝集反应为何要在适量电解质存在的 情况下才能进行？ #(二)生理盐水中的电解质在凝集反应中有 什么作用？ #(三)试管凝集反应与玻片凝集反应各有什 么优点？

问题与讨论 (一)凝集反应为何要在适量电解质存在的 情况下才能进行? (二)生理盐水中的电解质在凝集反应中有 什么作用? (三)试管凝集反应与玻片凝集反应各有什 么优点?