南京师范大学：《微生物学》课程PPT教学课件（实验指导）实验九 噬菌体的分离

实验九噬菌体的分离 何伟06一04

实验九 噬菌体的分离 何伟 06－04

实验目的 。1、利用噬菌体的一些生物特性，从自然 环境中分离、纯化大肠杆菌噬菌体，掌 握噬菌体分离纯化的基本原理和方法。 ·2、在实验过程观察噬菌斑的形态，和细 菌菌落进行对照加深印象。 。3、绘出平版中噬菌斑的形态特征

实验目的 ⚫ 1、利用噬菌体的一些生物特性，从自然 环境中分离、纯化大肠杆菌噬菌体，掌 握噬菌体分离纯化的基本原理和方法。 ⚫ 2、在实验过程观察噬菌斑的形态，和细 菌菌落进行对照加深印象。 ⚫ 3、绘出平版中噬菌斑的形态特征

实验原理 噬菌体是专性寄生物，所以自然界凡是有细菌分 布的地方，都可发现其特异的噬菌体存在。如粪 便与阴沟污水中含有大量大肠杆菌，固也能很容 易地分离到大肠杆菌噬菌体。噬菌体颗粒可以 独立存活（当然不能生长）。 噬菌体存在的特征是使含有特定宿主的菌悬液 由浑浊变清亮或者在有宿主细胞生长的琼脂平板 上形成透明的或浑浊的空斑，称噬菌斑。 本实验是从阴沟污水中分离大肠杆菌噬菌体，刚 分离出来的噬菌体常不纯，如表现在噬菌班的形 态、大小不一致等，可再作进一步纯化

实验原理 ⚫ 噬菌体是专性寄生物，所以自然界凡是有细菌分 布的地方，都可发现其特异的噬菌体存在。如粪 便与阴沟污水中含有大量大肠杆菌，固也能很容 易地分离到大肠杆菌噬菌体 。噬菌体颗粒可以 独立存活（当然不能生长）。 ⚫ 噬菌体存在的特征是使含有特定宿主的菌悬液 由浑浊变清亮或者在有宿主细胞生长的琼脂平板 上形成透明的或浑浊的空斑，称噬菌斑。 本实验是从阴沟污水中分离大肠杆菌噬菌体，刚 分离出来的噬菌体常不纯，如表现在噬菌班的形 态、大小不一致等，可再作进一步纯化

实验器材 ●仪器设备： 500ml三角瓶、中试管、培养皿、 无菌不锈钢涂布器、无菌吸管、无菌滤器（孔 径0.22um)、恒温水浴锅、真空泵、恒温培养 箱、灭菌锅、抽滤瓶等 。试剂：大肠杆菌、三倍浓缩的牛肉膏蛋白胨 液体培养基、含琼脂0.7%、2%的半固体、固 体培养基、阴沟污水、无菌水等

实验器材 ⚫ 仪器设备： 500ml三角瓶、中试管、培养皿、 无菌不锈钢涂布器、无菌吸管、无菌滤器（孔 径0.22um）、恒温水浴锅、真空泵、恒温培养 箱、灭菌锅、抽滤瓶等 ⚫ 试剂： 大肠杆菌、三倍浓缩的牛肉膏蛋白胨 液体培养基、含琼脂0.7%、2%的半固体、固 体培养基、阴沟污水、无菌水等

实验步骤 1. 制备大肠杆菌菌悬液37℃培养18小时的大肠 杆菌斜面一只，加无菌水5ml洗下菌苔，制成菌悬液。 2.增殖培养把200ml污水加到有100ml三倍浓缩的 牛肉膏蛋白胨培养液的三角瓶中，再加入2ml大肠杆 菌菌悬液，37℃振荡培养24~48小时。 ● 3.制备裂解液将上述液体以5000r/min离心l5min。 以无菌操作把无菌滤器安装于灭菌抽滤瓶上，正常 过滤除菌。滤液37℃培养过夜，以作无菌检查。 4.确证实验检查噬菌体是否真的存在（看大肠杆 菌平板上能否长出噬菌斑》

实验步骤 ⚫ 1．制备大肠杆菌菌悬液 37℃培养18小时的大肠 杆菌斜面一只，加无菌水5ml洗下菌苔，制成菌悬液。 ⚫ 2．增殖培养 把200ml污水加到有100ml三倍浓缩的 牛肉膏蛋白胨培养液的三角瓶中，再加入2ml大肠杆 菌菌悬液，37℃振荡培养24～48小时。 ⚫ 3．制备裂解液 将上述液体以5000r/min离心15min。 以无菌操作把无菌滤器安装于灭菌抽滤瓶上，正常 过滤除菌。滤液37℃培养过夜，以作无菌检查。 ⚫ 4．确证实验 检查噬菌体是否真的存在（看大肠杆 菌平板上能否长出噬菌斑）

5. 噬菌体的纯化 (1)把具有噬菌体的滤液接种一环于液体培养 基内，再加入0.lml大肠杆菌菌悬液，充分混合。 (2)在固体琼脂平板上倒入5ml融化并冷却到 48℃半固体培养基，加入(1)中混合液0.2ml, 立即混匀，铺平，37℃正置培养24小时。 (3)取大肠杆菌的噬菌斑（中部）一环，接种 于大肠杆菌培养液内，37℃培养，即可得到纯化 的噬菌体。 ● 6.高效价噬菌体的制备将纯化的噬菌体滤液 与培养液1：10混合，再加入适量（与噬菌体滤 液等量或1/2的量)的大肠杆菌菌悬液，培养增 殖，重复数次，最后过滤，可得到高效价噬菌体 的制品

⚫ 5．噬菌体的纯化 （1） 把具有噬菌体的滤液接种一环于液体培养 基内，再加入0.1ml大肠杆菌菌悬液，充分混合。 （2） 在固体琼脂平板上倒入5ml融化并冷却到 48℃半固体培养基，加入（1）中混合液0.2ml， 立即混匀，铺平，37℃正置培养24小时。 （3） 取大肠杆菌的噬菌斑（中部）一环，接种 于大肠杆菌培养液内，37℃培养，即可得到纯化 的噬菌体。 ⚫ 6. 高效价噬菌体的制备 将纯化的噬菌体滤液 与培养液1：10混合，再加入适量（与噬菌体滤 液等量或1/2的量）的大肠杆菌菌悬液，培养增 殖，重复数次，最后过滤，可得到高效价噬菌体 的制品

实验结果 。绘出平板中噬菌斑的形态特征

实验结果 ⚫ 绘出平板中噬菌斑的形态特征