华南师范大学：《遗传学》课程教学资源（实验指导）实验十二 人体微量血细胞培养（全血培养）及染色体制片

（十二）人体微量血细胞培养（全血培养）及染色体制片一、原理在正常情况下哺乳动物的外周血中是没有分裂相的，只有在异常的情况下才能发现。低等动物如在两栖类的外周血中也只是偶尔能见到分裂相1960年Nowell和Morhead证验，用来使红细胞凝集从而能分离出白细胞的植物血球激素（Phytohemagglutinin，PHA），它是人和其它动物淋巴细胞的有丝分剃的刺激剂。在PHA的作用下，原来处于G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进行有丝分裂，因而可以迅速而又简便地获得体外生长的细胞群体和有丝分裂相。淋巴细胞经过培养以后，形成了体外活跃生长的细胞群体，此后的步骤同于骨髓染包体制片程序。但本实验将更多地介绍一些空气干燥法的细节，以使初学读者能有更多的了解。人体微量血培养是最简单的淋巴细胞培养的方法。采取微量的末稍血，在PHA的作用下，进行短期培养，便可获得丰富的具有分裂相淋巴母细胞。微量未稍血培养具有操作简单，用血量少的优点，因此在临床的染色体诊断上是经常使用的一种获得有丝分别相的方法其他动物布制备染色体时也可以采用这种方法，但应根据对象进行适当的改动。即使是人体的外周血，在培养时也会由于个体差异、培养的条件及操作者本人的经验而又有相当的差异。二、器材和试剂(一)器材静脉取血装置或采血耳针：20毫升培养瓶：吸管：注射器、5号针头：10毫升刻度离心管：载玻片和盖片：显微镜；恒温箱，离心机。(二) 试剂1.培养基：199（或Eaglel'sMEM：RPMI1640)4毫升小牛血清1毫升PHA1%，（广州医药制品研究所）0.075毫升盐水提取法自制PHA10%0.1毫升双抗：（青霉素1万单位/毫升，链霉素1万单位/毫升）0.04毫升用4%NaHC03调至pH7.2。PHA1%和PHA10%任选一种。2.肝素生理盐水配成500单位/毫升3.秋水仙素4微克/毫升。（以上溶液高压灭菌）4.0.075MKCI5.甲醇6冰醋酸7.0.01M磷酸缓冲液（PBS），pH6.8

（十二）人体微量血细胞培养 ( 全血培养 ) 及染色体制片 一、原理 在正常情况下哺乳动物的外周血中是没有分裂相的，只有在异常的情况下才能发现。低等动物如在两栖类的外周血 中也只是偶尔能见到分裂相。 1960 年 Nowell 和 Morhead 证验，用来使红细胞凝集从而能分离出白细胞的植物血球凝 素 (Phytohemagglutinin ， PHA) ，它是人和其它动物淋巴细胞的有丝分剃的刺激剂。在 PHA 的作用下，原来处于 G 0 期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进行有丝分裂，因而可以迅速而又简便地获得体外生长的细胞群体和有丝分裂 相。 淋巴细胞经过培养以后，形成了体外活跃生长的细胞群体，此后的步骤同于骨髓染包体制片程序。但本实验将更多 地介绍一些空气干燥法的细节，以使初学读者能有更多的了解。 人体微量血培养是最简单的淋巴细胞培养的方法。采取微量的末稍血，在 PHA 的作用 下，进行短期培养，便可获 得丰富的具有分裂相淋巴母细胞。微量末稍血培养具有操作简 单，用血量少的优点，因此在临床的染色体诊断上 是经常使用的一种获得有丝分别相的方 法． 其他动物布制备染色体时也可以采用这种方法，但应根据对象进行适当的改动。即使是 人体的外周血，在培养时 也会由于个体差异、培养的条件及操作者本人的经验而又有相当的差异。 二、器材和试剂 （一）器材 静脉取血装置或采血耳针； 20 毫升培养瓶；吸管；注射器、 5 号针头； 10 毫升刻度离心管；载玻片和盖片；显微 镜；恒温箱，离心机。 （二）试剂 1 ．培养基： 199( 或 Eaglel's MEM ； RPMI 1640) 4 毫升 小牛血清 1 毫升 PHA 1 ％， ( 广州医药制品研究所 ) 0.075 毫升 盐水提取法自制 PHA 10 ％ 0.1 毫升 双抗： ( 青霉素 l 万单位／毫升，链霉素 1 万单位／毫升 ) 0.04 毫升 用 4%NaHC0 3 调至 pH 7.2 。 PHA 1% 和 PHA 10% 任选一种。 2 ．肝素生理盐水配成 500 单位／毫升 3 ．秋水仙素 4 微克／毫升。 ( 以上溶液高压灭菌 ) 4 ． 0.075 M KCl 5 ．甲醇 6 ．冰醋酸 7 ． 0.01M 磷酸缓冲液 (PBS) ， pH 6.8

8Giemsa原液三、实验步骤1：用经肝素湿润的2毫升注射器，自静脉或耳垂、手指取血0.5-1.0毫升2：每5毫升培养基中加全血0.3-0.4毫升，塞紧瓶塞后置37℃C箱中培养72小时3.秋水仙素处理：培养至68小时左右，在火焰保护下加适量秋水仙素（用1毫升注射器，5号针头），每毫升培养基中加一滴4微克/毫升的秋水仙素溶液，使终浓度为0.05微克/毫升培养基，以使细胞抑止在分裂中期。摇匀后，继续培养4小时即可进行染色体制片。适量的秋水仙素，适宜的处理时间，是获得良好分裂相的先决条件。这将影响分裂相的多少和染色体的长短。4，低渗处理：用吸管温和吹打细胞悬液，移入10毫升离心管中，1000rpm离心10分钟（或3500rpm离心1分钟），弃上清液。加入少量预热（37℃）的0.075MKCI，吹打成细胞悬液后，加入预热的低渗液6－8毫升，37℃低渗处理25分钟。在整个操作过程中，要注意不要将细胞吸到吸管上部，也不要接触离心管的上部，否则将会丢失许多细胞5：固定：预固定：低渗处理后，向低渗液中加入新鲜配制的12毫升固定液（3：1=甲醉：冰醋酸）进行预固定，以防上低渗处理后的细胞在离心时结团。固定液要沿管壁缓缓加入，然后用吹气的方法混匀。第一次固定：预固定1-2分钟后，离心去上清液（离心速度同上）。然后向离心管加入0.5毫升左右的固液，将细胞轻轻吹打成细胞悬液后，加固定液3--5毫升。混匀后固定15-30分钟。第二次固定：离心后去上清液，加固定液3--5毫升，混匀后固定1530分钟第三次固定：操作同前。第三次固定后，经离心后去掉大部上清液，只留0.1-0.2毫升固定液，混匀后即可滴片制作染色体。第二次固定后也可静置至第二天，吸去部分上清液后，即可进行制片。固定液要新鲜配制，否则将会形成酯类，从而影响固定的效果。6。滴片：使用以高纯水制备的冰水片进行滴片。用吸管吸取细胞悬液，距玻片5厘米左右的距离滴片。每张载片滴1--3滴（根据细胞悬液的浓度）。滴片后斜放，室温中空气干燥亦可滴片后立刻用嘴轻轻吹片，可帮助细胞和染色体分散。滴片是制备染色体的最后一步，也是非常关键的一步，首先载片要非常于净，否则将含影响染色体的分散和分带的效果。其次，滴片的距离、滴加量的多少，制片的方式都会影响到染色体分散的效果。7：Giemsa染色：取1--2张片（多数制片留下来做分带）用约3毫升Giemsa染液进行扣染。染液为1/10的Giemsa染液。染色30分钟后，自来水冲洗，凉干。四、观察1.在低倍和中倍镜下，观察分裂相的多少和染色体制片的质量2.寻找分散适宜，不重叠，收缩适中，染色体不过度分开，染色体硬的分裂相。3.观察男性和女性的正常染色体制片，确定其性别。在正常情况下，人的Y染包体与G组的2个染色体相似，借助这一点可根据染色体的形态对性别作一初步的判断。4、选择实验者本人的一个有代表性分裂相，拍照后进行核型分析，并做出核型图

8 ． Giemsa 原液 三、实验步骤 1 ．用经肝素湿润的 2 毫升注射器，自静脉或耳垂、手指取血 0.5-1.0 毫升。 2 ．每 5 毫升培养基中加全血 0.3-0.4 毫升，塞紧瓶塞后置 37 ℃ 箱中培养 72 小时。 3 ．秋水仙素处理：培养至 68 小时左右，在火焰保护下加适量秋水仙素 ( 用 1 毫升注射器， 5 号针头 ) ，每毫升培 养基中加一滴 4 微克／毫升的秋水仙素溶液，使终浓度为 0.05 微克 / 毫升培养基，以使细胞抑止在分裂中期。摇匀 后，继续培养 4 小时即可进行染色体制片。适量的秋水仙素，适宜的处理时间，是获得良好分裂相的先决条件。这 将影响分裂相的多少和染色体的长短。 4 ．低渗处理：用吸管温和吹打细胞悬液，移入 10 毫升离心管中， 1000rpm 离心 10 分钟 ( 或 3500rpm 离心 1 分钟 ) ，弃上清液。加入少量预热 ( 37 ℃ ) 的 0.075MKCl ，吹打成细胞悬液后，加入预热的低渗液 6 － 8 毫升， 37 ℃ 低渗处理 25 分钟。 在整个操作过程中，要注意不要将细胞吸到吸管上部，也不要接触离心管的上部，否则将会丢失许多细胞。 5 ．固定： 预固定：低渗处理后，向低渗液中加入新鲜配制的 1 － 2 毫升固定液 (3 ： 1 ＝甲醉：冰醋酸 ) 进行预固定，以防上 低渗处理后的细胞在离心时结团。固定液要沿管壁缓缓加入，然后用吹气的方法混匀。 第一次固定：预固定 1-2 分钟后，离心去上清液 ( 离心速度同上 ) 。然后向离心管加入 0.5 毫升左右的固液，将细 胞轻轻吹打成细胞悬液后，加固定液 3-5 毫升。混匀后固定 15-30 分钟。 第二次固定：离心后去上清液，加固定液 3-5 毫升，混匀后固定 15 － 30 分钟。 第三次固定：操作同前。第三次固定后，经离心后去掉大部上清液，只留 0.1-0.2 毫升固定液，混匀后即可滴片制 作染色体。第二次固定后也可静置至第二天，吸去部分上清液后，即可进行制片。 固定液要新鲜配制，否则将会形成酯类，从而影响固定的效果。 6 ．滴片：使用以高纯水制备的冰水片进行滴片。用吸管吸取细胞悬液，距玻片 5 厘米左右的距离滴片。每张载片 滴 1-3 滴 ( 根据细胞悬液的浓度 ) 。滴片后斜放，室温中空气干燥。 亦可滴片后立刻用嘴轻轻吹片，可帮助细胞和染色体分散。 滴片是制备染色体的最后一步，也是非常关键的一步，首先载片要非常于净，否则将含影响染色体的分散和分带的 效果。其次，滴片的距离、滴加量的多少，制片的方式都会影响到染色体分散的效果。 7 ． Giemsa 染色：取 1-2 张片 ( 多数制片留下来做分带 ) 用约 3 毫升 Giemsa 染液进行扣 染。染液为 1 ／ 10 的 Giemsa 染液。染色 30 分钟后，自来水冲洗，凉干。 四、观察 1 ．在低倍和中倍镜下，观察分裂相的多少和染色体制片的质量。 2 ．寻找分散适宜，不重叠，收缩适中，染色体不过度分开，染色体“硬”的分裂相。 3 ．观察男性和女性的正常染色体制片，确定其性别。在正常情况下，人的 Y 染包体与 G 组的 2 个染色体相似，借 助这一点可根据染色体的形态对性别作一初步的判断。 4 、选择实验者本人的一个有代表性分裂相，拍照后进行核型分析，并做出核型图