《仪器分析》课程教学资源（教案讲义）第八章 高效液相色谱法

第八章高效液相色谱法【教学目的】1．了解高效液相色谱法的优点及适用范围。2．了解高效液相色谱仪的主要部件及高效液相色谱法基本流程。3.理解常用检测器的原理、适用的分析对象及适用范围。4．理解各种分离方式的原理及选择原则。【教学重点和难点】1.高效液相色谱法的各种分离类型2.高效液相色谱固定相【教学方法】讲授、讨论、多媒体【教学时数】4课时【教学过程】第一节概述液相色谱（Liquidchromatography）高效液相色谱（Highperformanceliquidchromatography）超临界流体色谱（Supercriticalfluidchromatography）高效毛细管电泳（Highperformancecapillaryelectrophoresis毛细管电色谱（Capillaryelectrochromatography）液相质谱联用技术（Liquidchromatography-MassSpectrometry）1.经典液相色谱与HPLC的区别（1采用了高压输液泵（2采用了新型的固定相（3采用了高灵敏度的检测器（4自动化程度高2．HPLC与GC的比较共同点：（1）色谱基本理论一致(2）定性定量分析原理一样（3）可对操作条件、数据处理进行程序控制，自动化程度高差异点：（1）流动相差异组分在液相中的扩散系数比在气相中的扩散系数小104～105倍，与固定相与流动相的作用力不能忽略。液体流动相多，气体流动相少，可供选择范围广。（2）固定相差别。（3）利用范围更广。GC15%，HPLC85%以上的物质均可测定。（4）仪器结构的原理上亦有差别。第二节HPLC类型及类型的选择一，液-液色谱正相色谱：固定相为极性的流动相为非极性或弱极性的液相色谱。流出顺序：非极性向极性过渡。反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性的液相色谱。流出顺序：极性向非极性过渡。正相离子对色谱：固定相为极性流动相为非极性或弱极性的并含有适当的有机反离子，这种反离子能与组分形成离子对的液相色谱。流出顺序：按离子对极性大小流出，极性小的先流出。反相离子对色谱：固定相为非极性流动相为极性的并含有适当的有机反离子，这种反离子能与组分形成离子对的液相色谱。流出顺序：按离子对极性大小流出，极性大的先流出。二、液-固色谱固体固定相表面的吸附活性中心对组分的吸附能力不同而达到分离的色谱。特点：1.对同系物的选择性小，不利于同系物的分离，而有利于按族的分离

第八章 高效液相色谱法 【教学目的】 1. 了解高效液相色谱法的优点及适用范围。 2. 了解高效液相色谱仪的主要部件及高效液相色谱法基本流程。 3. 理解常用检测器的原理、适用的分析对象及适用范围。 4. 理解各种分离方式的原理及选择原则。 【教学重点和难点】 1. 高效液相色谱法的各种分离类型 2. 高效液相色谱固定相 【教学方法】 讲授、讨论、多媒体 【教学时数】 4课时 【教学过程】 第一节 概述 液相色谱( Liquid chromatography ) 高效液相色谱( High performance liquid chromatography) 超临界流体色谱( Supercritical fluid chromatography) 高效毛细管电泳(High performance capillary electrophoresis) 毛细管电色谱(Capillary electrochromatography) 液相质谱联用技术（Liquid chromatography- Mass Spectrometry） 1．经典液相色谱与HPLC的区别 (1 采用了高压输液泵 (2 采用了新型的固定相 (3 采用了高灵敏度的检测器 (4 自动化程度高 2． HPLC与GC的比较 共同点: （1）色谱基本理论一致 (2) 定性定量分析原理一样 (3) 可对操作条件、数据处理进行程序控制,自动化程度高 差异点: (1) 流动相差异组分在液相中的扩散系数比在气相中的扩散系数小104～105倍,与固定相与流动相的作用力不能忽 略。液体流动相多,气体流动相少,可供选择范围广。(2) 固定相差别。(3) 利用范围更广。GC 15％，HPLC 85％以上的物 质均可测定。(4) 仪器结构的原理上亦有差别。 第二节 HPLC类型及类型的选择 一．液-液色谱 正相色谱: 固定相为极性的流动相为非极性或弱极性的液相色谱。 流出顺序:非极性向极性过渡。 反相色谱: 固定相为非极性,流动相为极性的液相色谱。 流出顺序:极性向非极性过渡。 正相离子对色谱: 固定相为极性流动相为非极性或弱极性的并含有适当的有机反离子,这种反离子能与组分形成离子对 的液相色谱。 流出顺序: 按离子对极性大小流出,极性小的先流出。 反相离子对色谱: 固定相为非极性流动相为极性的并含有适当的有机反离子,这种反离子能与组分形成离子对的液相色 谱。 流出顺序: 按离子对极性大小流出,极性大的先流出。 二．液-固色谱 固体固定相表面的吸附活性中心对组分的吸附能力不同而达到分离的色谱。 特点: 1. 对同系物的选择性小,不利于同系物的分离,而有利于按族的分离

1吸附中心的吸附力与分子的几何形状有关，有利于异构体的分离。3.由于吸附中心主要是表面的硅醇结构，吸附能力大小决定于羟基对组分分子吸附与解吸能力的强弱，因此对流动相含水量要严格控制，方能得到良好的重复性，三：离子交换色谱利用固定相中离子交换基团与组分离子的交换能力的不同而达到分离的液相色谱。R+ r- + X- == R+X- + r-R+r-阴离子交换树脂X-组分离子r-平衡离子四：凝胶色谱（排阻色谱，空间排阻色谱）利用固定相凝胶内孔穴大小与组分分子大小而进行分离的一种技术，分子体积大，不能渗透到孔穴内部去，较快流出色谱柱，相反较慢流出色谱柱。凝胶过滤色谱（GelFiltrationChromatography，GFC)：用含水的流动相的凝胶色谱。凝胶渗透色谱（GelpermeationChromatography，GPC)非水流动相的凝胶色谱。五.液相色谱分离机理示意图六．分离类型的选择第三节高效液相色谱仪HPLC仪的基本构成（一)流动相输送系统1.贮液糟2.高压泵要求：A.较高压力300500KG/CM2B.无脉冲C.流速稳定性士1%，重复性土0.5%D.泵室体积小E.分析用泵最大流速3毫升/min以上：制备用泵最大流速50毫升/min以上。3：梯度淋洗装置(二)进样系统进样阀，注射器（与气相色谱相同）。(三)色谱分离系统色谱柱：不锈钢柱，固定相恒温器：（通常柱温：室温~65℃）A.柱温升高6℃，组分保留值减少30%左右。B.温度升高，传质阻力减少（C项降低），柱效增加。C.降低流动相粘度，压力下降。(四)检测系统光学检测器：紫外一可见光、荧光、红外、二极管阵列检测器、质谱等。电学检测器：库仑、电导检测器等。（数据处理和记录系统与GC完全相同。第四节高效液相色谱固定相一，液-液色谱固定相主要采用化学键合固定相：即以硅胶为担体，在其表面硅醇基团上，键合了特效基团。化学键合固定相特点：I、由于表面键合了特效基团，消除了表面的吸附活性点，使表面更均一。2、柱效高，峰形对称。3、可通过键合不同基团来改变选择性。4、无固定液流失，柱寿命长，稳定性好。5、耐各种溶剂，有利于梯度淋洗和样品、溶剂的回收。6、价格高。二，液-固色谱固定相以硅胶为基体的各类硅珠，主要有三种类型：全多孔硅珠：多孔层硅珠：堆积型硅珠。目前常用的是全多孔硅珠

1 吸附中心的吸附力与分子的几何形状有关,有利于异构体的分离。 3. 由于吸附中心主要是表面的硅醇结构,吸附能力大小决定于羟基对组分分子吸附与解吸能力的强弱,因此对流 动相含水量要严格控制,方能得到良好的重复性。 三．离子交换色谱 利用固定相中离子交换基团与组分离子的交换能力的不同而达到分离的液相色谱。 R+ r- + X- == R+X- + r￾R+ r- 阴离子交换树脂 X- 组分离子r- 平衡离子 四．凝胶色谱(排阻色谱,空间排阻色谱) 利用固定相凝胶内孔穴大小与组分分子大小而进行分离的一种技术,分子体积大,不能渗透到孔穴内部去,较快流出色谱 柱,相反较慢流出色谱柱。 凝胶过滤色谱(Gel Filtration Chromatography, GFC): 用含水的流动相的凝胶色谱。 凝胶渗透色谱(Gel permeation Chromatography, GPC) 非水流动相的凝胶色谱。 五．液相色谱分离机理示意图 六．分离类型的选择 第三节 高效液相色谱仪 HPLC仪的基本构成 (一)流动相输送系统 1. 贮液糟 2. 高压泵 要求: A.较高压力300～500KG/CM2 B.无脉冲 C.流速稳定性±1%,重复性±0.5% D.泵室体积小 E.分析用泵最大流速3毫升/min以上；制备用泵最大流速50毫升/min以上。 3. 梯度淋洗装置 (二)进样系统 进样阀,注射器（与气相色谱相同）。 (三)色谱分离系统 色谱柱:不锈钢柱, 固定相 恒温器：（通常柱温：室温～65℃） A.柱温升高6℃，组分保留值减少30％左右。 B.温度升高，传质阻力减少（C项降低），柱效增加。 C.降低流动相粘度，压力下降。 (四)检测系统 光学检测器：紫外－可见光、荧光、红外、二极管阵列检测器、质谱等。 电学检测器：库仑、电导检测器等。 (数据处理和记录系统 与GC完全相同。 第四节 高效液相色谱固定相 一．液-液色谱固定相 主要采用化学键合固定相：即以硅胶为担体，在其表面硅醇基团上，键合了特效基团。 化学键合固定相特点： 1、由于表面键合了特效基团，消除了表面的吸附活性点，使表面更均一。 2、柱效高，峰形对称。 3、可通过键合不同基团来改变选择性。 4、无固定液流失，柱寿命长，稳定性好。 5、耐各种溶剂，有利于梯度淋洗和样品、溶剂的回收。 6、价格高。 二．液-固色谱固定相 以硅胶为基体的各类硅珠，主要有三种类型：全多孔硅珠；多孔层硅珠；堆积型硅珠。目前常用的是全多孔硅珠

柱效以堆积型最好，多孔层次之。全多孔最好。固定相粒度对柱效影响很大，粒度小，板高低，柱效高。三离子交换固定相主要有两种类型：1.硅质键合离子交换基团或涂覆一层离子交换树脂2.苯乙烯与二乙烯基苯共聚物为基质键合离子交换基团四凝胶色谱固定相主要有三种类型：1.软性凝胶：SephadexG系列，不适用于HPLC2.半软性凝胶：压力不能超过150kg/cm2，主要为聚苯乙烯凝胶。3.刚性凝胶：多孔硅胶，多孔破璃，主要用于HPLC。第五节液相色谱流动相1对流动相的要求21.惰性2．对样品有较大的溶解度3．对所选用的检测器没有干扰4．粘度少，扩散系数要大，以减少传质阻力5.纯度高，成本低6.毒性少，稳定性好二，溶剂的极性溶剂的极性大小，可用溶剂强度表示，溶剂强度大致如下：正庚烷<正已烷<环已烷<CC14<苯<乙醚<CHC13<CH2C12<四氢哺<二氧六烷<丙酮<醋酸乙酯<乙腈<甲醇<水液液色谱流动相的选择原则三.1．正相色谱A选择单一非极性溶剂，使所有的组分的1≤k'≤10。BB.加极性改性剂（甲醇、四氢呋喃、CHC13等）。2．反相色谱A.以水作为基体。C加溶剂甲醇、乙睛等改性。D3．离子对色谱主要选择反离子和浓度，然后按正相或反相色谱流动相选择原则选择即可。四液固色谱流动相选择原则1．选择正确的溶剂强度使所有的组分的分配比在1≤k≤10之间。2．选择适当的溶剂组成。3、严格控制流动相的含水量。五：离子交换色谱流动相选择原则1、选择pH值。2、选择离子强度。3、选择缓冲溶液。六凝胶色谱流动相选择原则1.控制分离温度下的粘度。2.流动相必须有较强的溶解样品的能力，第六节液相色谱检测器紫外吸收检测器示差折光检测器荧光检测器

柱效以堆积型最好，多孔层次之。全多孔最好。 固定相粒度对柱效影响很大，粒度小，板高低，柱效高。 三．离子交换固定相 主要有两种类型： 1.硅质键合离子交换基团或涂覆一层离子交换树脂 2.苯乙烯与二乙烯基苯共聚物为基质键合离子交换基团 四．凝胶色谱固定相 主要有三种类型： 1.软性凝胶：Sephadex G 系列, 不适用于HPLC 2.半软性凝胶：压力不能超过150kg/cm2, 主要为聚苯乙烯凝胶。 3.刚性凝胶：多孔硅胶,多孔破璃,主要用于HPLC。 第五节 液相色谱流动相 1 对流动相的要求 2 1. 惰性 2. 对样品有较大的溶解度 3. 对所选用的检测器没有干扰 4. 粘度少，扩散系数要大，以减少传质阻力 5. 纯度高，成本低 6. 毒性少，稳定性好 二．溶剂的极性 溶剂的极性大小,可用溶剂强度表示,溶剂强度大致如下： 正庚烷＜正已烷＜环已烷＜CCl4＜苯＜乙醚＜CHCl3<CH2Cl2＜四氢呋喃＜二氧六烷＜丙酮＜醋酸乙酯＜乙腈＜甲醇＜ 水 三．液液色谱流动相的选择原则 1．正相色谱 A 选择单一非极性溶剂，使所有的组分的1≤k’≤10。 B B．加极性改性剂（甲醇、四氢呋喃、CHCl3等）。 2．反相色谱 A．以水作为基体。 C 加溶剂甲醇、乙腈等改性。 D 3．离子对色谱 主要选择反离子和浓度，然后按正相或反相色谱流动相选择原则选择即可。 四．液固色谱流动相选择原则 1．选择正确的溶剂强度 使所有的组分的分配比在1≤k’≤10之间。 2．选择适当的溶剂组成。 3、严格控制流动相的含水量。 五．离子交换色谱流动相选择原则 1、选择pH值。 2、选择离子强度。 3、选择缓冲溶液。 六．凝胶色谱流动相选择原则 1．控制分离温度下的粘度。 2．流动相必须有较强的溶解样品的能力。 第六节 液相色谱检测器 紫外吸收检测器 示差折光检测器 荧光检测器

二极管阵列检测器电导检测器安培检测器高效液相色谱应用：（一）正相色谱的应用适用范围：（1）由反相色谱法很难分离的异构体可以采用以硅胶为固定相的正相色谱分离分析：（2）根据被分离样品的极性差别进行族类分离：（3）易于水解样品的分离分析：（4）在极性有机溶液中溶解度很小的高油溶性样品的分离分析。（二）反相色谱的应用反相色谱在食品分析中的应用1．食品本身组成，尤其是营养成分的分析（蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、脂肪酸、香料、有机酸、有机胺、矿物质等）2.食品添加剂分析（甜味剂、防腐剂、着色剂、抗氧剂）3．在食品的加工、贮运、保存过程中由周围环境引起的污染物分析（农药残留、霉菌毒素、病原微生物）【布置作业】P231-2321-19【教学后记】

二极管阵列检测器 电导检测器 安培检测器 高效液相色谱应用: （一）正相色谱的应用 适用范围： (1）由反相色谱法很难分离的异构体可以采用以硅胶为固定相的正相色谱分离分析； (2）根据被分离样品的极性差别进行族类分离； (3）易于水解样品的分离分析； (4）在极性有机溶液中溶解度很小的高油溶性样品的分离分析。 （二）反相色谱的应用 反相色谱在食品分析中的应用 1. 食品本身组成，尤其是营养成分的 分析（蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、脂肪酸、香料、有机酸、有机 胺、矿物质等） 2. 食品添加剂分析（甜味剂、防腐剂、着色剂、抗氧剂） 3. 在食品的加工、贮运、保存过程中由周围环境引起的污染物分析（农药残留、霉菌毒素、病原微生物） 【布置作业】P231-232 1-19 【教学后记】