河南农业大学：《生物化学》课程教学资源（实验指导）实验八 硝酸还原酶活性测定

实验八硝酸还原酶活性测定 一、目的 硝酸还原酶是植物氮素代谢中的关键酶之一，它与作物吸收利用氮肥有关， 对作物的产量和品质有影响。因而可以把硝酸还原酶的活力当作植物营养或农田 施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。通过本实验可初步掌握测定硝 酸还原酶活性的原理与方法。 二、原理 硝酸还原酶能将NO;还原成NO2 NO5+NADH+H整ENO5+NAD·+0 产生的NO2ˉ的量与硝酸还原酶的活性相关。通过测定反应液中产生的NO2 含量，即可确定酶活性大小。 NO2ˉ含量可用磺胺显色法测定。NO2ˉ与磺胺及a一萘胺在酸性条件下生成红 色偶氮化合物其反应如下： NH, N=N +NO+2H*+CH +2H,O HCI S03 NH: (红色偶氮化合物) 酶活性可用单位鲜重组织在单位时间内产生的亚硝酸量来表示： 亚硝酸态氮微克数/克鲜重组织1小时。 三、实验材料、仪器和试剂 1.实验材料植物的根、茎、叶，本实验选用白萝卜叶片 2.仪器 (1)分光光度计(2)离心机(3)真空泵和真空干燥器 (4)恒温水浴锅(5)恒温箱(6)刻度吸管(1ml、2ml、5ml) (7)试管 (8)天平(9)三角瓶(50ml) 3.试剂 (1)亚硝酸钠标准液：称取0.1000g亚硝酸钠(AR),用蒸馏水溶解并定容

实验八 硝酸还原酶活性测定 一、目 的 硝酸还原酶是植物氮素代谢中的关键酶之一，它与作物吸收利用氮肥有关， 对作物的产量和品质有影响。因而可以把硝酸还原酶的活力当作植物营养或农田 施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。通过本实验可初步掌握测定硝 酸还原酶活性的原理与方法。 二、原 理 硝酸还原酶能将 NO3 －还原成 NO2 － 产生的 NO2 －的量与硝酸还原酶的活性相关。通过测定反应液中产生的 NO2 － 含量，即可确定酶活性大小。 NO2 －含量可用磺胺显色法测定。NO2 －与磺胺及 a－萘胺在酸性条件下生成红 色偶氮化合物 其反应如下： 酶活性可用单位鲜重组织在单位时间内产生的亚硝酸量来表示： 亚硝酸态氮微克数/克鲜重组织 1 小时。 三、实验材料、仪器和试剂 1．实验材料 植物的根、茎、叶，本实验选用白萝卜叶片 2．仪器 （1）分光光度计（2）离心机（3）真空泵和真空干燥器 （4）恒温水浴锅（5）恒温箱（6）刻度吸管（lml、2ml、5ml） （7）试管 （8）天平 （9）三角瓶（50ml） 3．试剂 （1） 亚硝酸钠标准液：称取 0.1000g 亚硝酸钠（AR），用蒸馏水溶解并定容

至100ml。然后吸取5ml再用蒸馏水定客至1000m1。即为浓度5μg/ml的亚硝 酸钠标准液。 885 的硝酸钾溶液 (4)1%对氨基苯磺磷酸 (5)2%a-蔡胺 (6)30%三氢乙酸 四、操作步骤 1.标准曲线的制作 取6支试管，编号，按下表操作 管号 操作项目 2 3 4 5 NaNO:淀标准液(ml 0 04 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水(ml 20 1.6 1.2 08 04 0 NaNO2含量(ng) 0 2 4 6 8 10 磺胺(ml 各4 a一恭按 各4 摇匀在30℃水浴中保温20分钟。然后在520ml波长下比色测定消光值。 以亚硝酸钠含量为横坐标，消光值为纵坐标绘制标准曲线。 2,酶反应和酶活性测定 将白萝卜叶片洗静，剪成0.5cmh的小片，混匀后称三份，每份0.5-1.0g 分另放人50ml的三角瓶中，编号按下表加试剂 试剂() 。瓶号 1 3 pn.5瞬酸缓冲液 4.0 4.0 4.0 0.2mdL-KN0,溶液 5.0 5.0 30%三氯乙酸 1.0 、0 0 摇匀，置真空于燥器中，抽气10分钟。然后将三角瓶放人恒温箱，在30℃暗 条件下保温30分钟。取出后向2,3号瓶中分别加人130%三氢乙酸终止反应 将反应液离心(3000mp10分钟)或过滤。分另吸取2m反应液于三只试管中名 加4ml1%磺胺和0.2%a一茶胺。 摇匀在30℃水浴中保温20分钟。然后在520ml波长下比色测定消光值。 五、结果与计算 酶活性（亚硝酸钠μg/g鲜重·h)=亚硝酸钠微克数（μg)×稀 释倍数/样品重(g)×时间(h) 六、注意事项 1.酶促反应在暗条件下进行，以防光照下叶绿体形成还原型铁氧还蛋白，促 使亚硝酸还原酶把NO2还原成NH

至 100ml。然后吸取 5ml 再用蒸馏水定客至 1000m1。即为浓度 5μg／ml 的亚硝 酸钠标准液。 （2）0.lmol·L －1pH7.5 磷酸缓冲液 （3）0.2 mol·L －1 的硝酸钾溶液 （4）1％对氨基苯磺磷酸 （5）2％α－萘胺 （6）30％三氯乙酸 四、操作步骤 1．标准曲线的制作 取 6 支试管，编号，按下表操作 操作项目 管 号 1 2 3 4 5 6 NaNO2淀标准液 (ml) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水(ml) 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0 NaNO2 含量（μg） 0 2 4 6 8 10 磺胺(ml) 各 4 α－萘胺 各 4 摇匀在 30℃水浴中保温 20 分钟。然后在 520ml 波长下比色测定消光值。 以亚硝酸钠含量为横坐标，消光值为纵坐标绘制标准曲线。 2．酶反应和酶活性测定 将白萝卜叶片洗静，剪成 0.5cm2h 的小片，混匀后称三份，每份 0.5－1.0g， 分另放人 50ml 的三角瓶中，编号按下表加试剂 摇匀，置真空于燥器中，抽气 10 分钟。然后将三角瓶放人恒温箱，在 30℃暗 条件下保温 30 分钟。取出后向 2，3 号瓶中分别加人 l ml 30％三氯乙酸终止反应， 将反应液离心（3000rmp 10 分钟）或过滤。分另吸取 2ml 反应液于三只试管中各 加 4ml 1％磺胺和 0.2％a－萘胺。 摇匀在 30℃水浴中保温 20 分钟。然后在 520ml 波长下比色测定消光值。 五、结果与计算 酶活性（亚硝酸钠μg／g 鲜重·h）＝亚硝酸钠微克数（μg）×稀 释倍数／样品重（g）×时间（h） 六、注意事项 1．酶促反应在暗条件下进行，以防光照下叶绿体形成还原型铁氧还蛋白，促 使亚硝酸还原酶把 NO2 还原成 NH3

2.田间采样应在早晨9点以后，光合作用进行了一段时间再进行

2．田间采样应在早晨 9 点以后，光合作用进行了一段时间再进行