厦门大学：《细胞与显微技术实验》课程教学资源（讲义）叶绿体的分离与观察

实验四叶绿体的分离与观察

实验四 叶绿体的分离与观察

实验四叶绿体的分离与观察

实验四 叶绿体的分离与观察

9.4IsolationandCharacterizationofCellOrganelles（细胞器）Centrifugationcan separatemanytypes of oganellesfromcellhomogenatearmoredchambersedimentingmaterialrotorrefrigerationvacuummotor

9.4 Isolation and Characterization of Cell Organelles (细胞器) Centrifugation can separate many types of oganelles from cell homogenate

9.4IsolationandCharacterizationofCell Organelles（细胞器）Centrifugation can separatemanytypes ofoganellesfromcellhomogenate→Fractionation（细胞组分的分级分离）Centrifugation techniques:(1）Differentialcentrifugation（差速离心）(2）Density-gradientcentrifugation（密度梯度离心

9.4 Isolation and Characterization of Cell Organelles (细胞器) Centrifugation can separate many types of oganelles from cell homogenate  Fractionation (细胞组分的分级分离). Centrifugation techniques: (1) Differential centrifugation (差速离心) (2) Density-gradient centrifugation (密度梯度离心)

9.4IsolationandCharacterizationofCellOrganelles（细胞器）Centrifugationcanseparatemanytypes ofoganellesfrom cellhomogenate,1st Step:Differential centrifugationFilterhomogenateto removeclumpsofunbrokencells,connectivetissue,etc.CentrifugeSupernatant(上清液)Pourout:rout:Pourout:100,0300,000gx15bo0gxDogx10min2hPourout5hin60mmPlasmaLRibosomalPelletSolubleFiltorNucleiLMitochondria,partofmembrane,chloroplasts,subunits,homogenate(颗粒团)microsomalsmallcytoplasmlysosomes,fractionandpolyribo-(cytosol)(fragmentsofsomesperoxisomesendoplasmicreticulum)and largepolyribosomes沉降顺序：细胞核一线粒体,溶酶体与过氧化物酶体一内质网与高尔基体一核糖体

9.4 Isolation and Characterization of Cell Organelles (细胞器) Centrifugation can separate many types of oganelles from cell homogenate, 1st Step: Differential centrifugation 沉降顺序：细胞核—线粒体,溶酶体与过氧化物酶体—内质网与高尔基体—核糖体。 Pellet (颗粒团) Supernatant (上清液)

9.4IsolationandCharacterizationofCellOrganelles（细胞器）Centrifugation can separatemany types of oganellesfrom cell homogenate,2nd Step:Density-gradient centrifugationOrganellefractionsse1.09Lysosomes(1.12 g/cm3)s1.111.15Mitochondria(1.18 g/cm3)1.191.22Peroxisomes1.25(1.23 g/cm3)BeforeAftercentrifugationcentrifugation常用介质（高溶解性的惰情性物质）：氯化、蔗糖、多聚蔗糖

常用介质(高溶解性的惰性物质): 氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖 9.4 Isolation and Characterization of Cell Organelles (细胞器) Centrifugation can separate many types of oganelles from cell homogenate, 2nd Step: Density-gradient centrifugation

实验四叶绿体的分离与观察实验原理1、密度梯度离心，当颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法，两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，离心时，叶绿体和比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分沉到离心管底部

实验四 叶绿体的分离与观察 一、 实验原理 1、密度梯度离心 • 当颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用 下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区 域上形成区带的方法。 • 两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，离心时，叶绿体 和比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处， 而沉降系数较大的细胞组分沉到离心管底部

2、叶绿体荧光·叶绿体受激发光照射后可直接发出红色荧光，称为自发荧光（或直接荧光）。·叶绿体吸附荧光染料吖啶橙后可发出橘红色荧光，这种荧光称为次生荧光（或间接荧光）

2、叶绿体荧光 • 叶绿体受激发光照射后可直接发出红色 荧光，称为自发荧光（或直接荧光）。 • 叶绿体吸附荧光染料吖啶橙后可发出橘 红色荧光，这种荧光称为次生荧光（或 间接荧光）

二、试剂与器材·器材普通离心机，组织捣碎机，电子天平，烧杯，量筒，移液枪，1.5mL离心管，试管架，纱布无荧光载玻片和盖玻片，普通光学显微镜，荧光显微镜。·试剂预冷的匀浆介质（0.05mol/LTris-HCI缓冲液，pH=7.4；0.25mol/L蔗糖），50%蔗糖溶液，15%蔗糖溶液，0.1%吖啶橙。·材料新鲜菠菜

二、试剂与器材 • 器材 普通离心机，组织捣碎机，电子天平，烧杯， 量筒，移液枪，1.5 mL 离心管，试管架，纱布， 无荧光载玻片和盖玻片，普通光学显微镜，荧光 显微镜。 • 试剂 预冷的匀浆介质（0.05mol/L Tris-HCl缓冲液， pH=7.4；0.25 mol/L 蔗糖），50%蔗糖溶液，15% 蔗糖溶液，0.1%吖啶橙。 • 材料 新鲜菠菜

50%三、 实验流程蔗糖溶液15%4层纱布过3 min0.4mL蔗糖溶液滤于烧杯中30g0.4mL0.6mL菠菜叶，洗净去叶梗和主脉100ml匀浆介质沿管壁缓慢加入制片镜检10uL8000r/min20min

三、实验流程 3 min 4层纱布过 滤于烧杯中 8000r/min 20min 制片 镜检 菠菜叶，洗净 去叶梗和主脉 匀浆介质 50% 蔗糖溶液 0.4mL 15% 蔗糖溶液 0.4mL 0.6mL 10 uL