厦门大学：《细胞与显微技术实验》课程教学资源（讲义）细胞荧光染色观察与荧光显微镜的使用

实验二、纟细胞荧光染色观察与荧光显微镜的使用

实验二、细胞荧光染色观察与 荧光显微镜的使用

一、荧光显微镜的成像原理荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，它是由光源、滤色镜系统和光学系统等主要部件组成。其基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测

一、荧光显微镜的成像原理 荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，它 是由光源、滤色镜系统和光学系统等主要部件组成。 其基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行 激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品 结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测

1、什么是荧光？HigerEnergyandVibration State某些物质经波长较短的光Lowest SingletExcitedStateSsSSSSSSSS照射后，分子被激活，吸收能Lossof Energyo量后呈激发态。其能量部分转化为热能或用于光化学反应外，相当一部GroundState分则以波长较长的光能形式辐Fluorescence射出来，这种波长长于激发光Withinfemtoseconds afler lightexcites thefluorophoreatanappropriate wavelength,its electrons jump trom theground statetoahigher vibrational state.Within picosecondsthese electrons decay to the lowest excited state,and then decay more slowly (nsec)issionofaphotonwhose.wavelengthislongerbacktothegroundstatewiththeen的可见光称为荧光。thantheexcitingwavelength,Clicktocontinue>>

1、什么是荧光 ? 某些物质经波长较短的光 照射后，分子被激活,吸收能 量后呈激发态。 其能量部分转化为热能或 用于光化学反应外，相当一部 分则以波长较长的光能形式辐 射出来，这种波长长于激发光 的可见光称为荧光

2、荧光的性质保持固有的荧光特性荧光波长>激发波长荧光强度小于激发光的强度一有不同程度的衰减荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度

保持固有的荧光特性 荧光波长＞激发波长 荧光强度小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度 2、荧光的性质

荧光的种类3、自发荧光次生荧光StainedAutofluorescenceRadiationStimulusEmitted LightNot stained一种是标本自身的原有荧光（自发荧光），另一种是利用荧光色素和细胞的特定部分反应所产生的荧光（次生荧光）

自发荧光 次生荧光 3、荧光的种类 一种是标本自身的原有荧光（自发荧光），另一种是利用荧光色 素和细胞的特定部分反应所产生的荧光（次生荧光）

荧光显微镜的优点和用途4、一优点：检出能力高对细胞的刺激小能进行多重染色用途：■物体构造的观察■荧光的有无、，色调比较进行物质判别发荧光量的测定对物质定性、定量分析

优点：  检出能力高  对细胞的刺激小  能进行多重染色 用途：  物体构造的观察  荧光的有无、色调比较进行物质判别  发荧光量的测定对物质定性、定量分析 4、荧光显微镜的优点和用途

荧光显微镜的基本结构组成一、光源由于标本发出的荧光和激发光相比，是非常微弱的，因此荧光显微镜的光源强度必须很高，所以对于荧光显微镜的光源我们通常采用高压汞灯汞灯能以最小的表面发出最大数量的紫外光和蓝光，且光亮度大，光度稳定。它是用石英玻璃制作，中间呈球形，有两个钨电极，内充一定数量的汞和少量氩氯混合气体

荧光显微镜的基本结构组成 一、光源 由于标本发出的荧光和激发光相比，是非常微弱的， 因此荧光显微镜的光源强度必须很高，所以对于荧光显微 镜的光源我们通常采用高压汞灯。 汞灯能以最小的表面发出最大数量的紫外光和蓝光， 且光亮度大，光度稳定。它是用石英玻璃制作，中间呈球 形，有两个钨电极，内充一定数量的汞和少量氩氖混合气 体

一、光源工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达50～70个标准大气压力，这一过程一般约需5～15min。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质。超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境温度不宜太高

工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压 迅速升高，当水银完全蒸发时，可达50～70个标准大气压 力，这一过程一般约需5～15min。 超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解 离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和 蓝紫光，足以激发各类荧光物质。 超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好 的散热条件，工作环境温度不宜太高。 一、光源

一、光源200W超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h的情况下约为200h，开动一次工作时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作20min，则寿命降低50%。因此，使用时尽量减少启动次数。灯泡在使用过程中其光效是逐渐降低的。灯熄灭后要等待冷却才能重新启动点燃灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15min

200W超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h的 情况下约为200h，开动一次工作时间愈短，则寿命 愈短，如开一次只工作20min，则寿命降低50%。 因此，使用时尽量减少启动次数。灯泡在使用 过程中其光效是逐渐降低的。灯熄灭后要等待冷却 才能重新启动。 点燃灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸发不完 全而损坏电极，一般需要等15min。 一、光源

、荧光显微镜的光路荧光显微镜按激发光对样品的激发方向或方式，分有两种：1．透射式荧光显微镜2．反射式（落射式）荧光显微镜

荧光显微镜按激发光对样品的激发方向 或方式，分有两种： 1．透射式荧光显微镜 2．反射式（落射式）荧光显微镜 二、荧光显微镜的光路