复旦大学：《药物分析》课程实验课件（仪器分析实验）荧光法测定硫酸奎宁溶液含量和四种物质的红外光谱测定

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荧光法测定 硫酸奎宁溶液的含量 复旦大学版权所有 1

Experimental purposes 1.掌握荧光法的原理与定量分析方法（标准曲线 法)； 2.熟悉荧光分光光度计的使用方法； 复旦大学版权所有

Experimental purposes 1. 掌握荧光法的原理与定量分析方法（标准曲线 法）； 2. 熟悉荧光分光光度计的使用方法； 复旦大学版权所有 2

Experimental Principle 物质分子接受光子能量被激发后，从第一激发 单重态的最低振动能级返回基态时发射出的光即为 荧光。 由于各种去活化过程的存在，荧光辐射能通常 要比激发能量低，或者说，荧光波长大于激发波长。 复旦大学版权所有

Experimental Principle 物质分子接受光子能量被激发后，从第一激发 单重态的最低振动能级返回基态时发射出的光即为 荧光。 由于各种去活化过程的存在，荧光辐射能通常 要比激发能量低，或者说，荧光波长大于激发波长。 复旦大学版权所有 3

Experimental Principle 荧光仪器 1)光源：氙灯、高压 激发单色器 样品池 汞灯、激光； 光源 2)样品池：石英（无 荧光发射)； 3)两个单色器：激发 发射单色 和发射； 指示器 4)检测系统：检测器 和放大器(PMT)。 放大器 检测器 记录器 复旦大学版权所有

Experimental Principle 1）光源：氙灯、高压 汞灯、激光； 2）样品池：石英（无 荧光发射）； 3）两个单色器：激发 和发射； 4）检测系统：检测器 和放大器（PMT）。 荧光仪器 光源 激发单色器 样品池 发 射 单 色 器 放大器 检测器 指示器· 记录器 复旦大学版权所有 4

Experimental Principle 1)激发光谱 (excitation spectrum,即EX) 激发光谱 荧光光谱 将激发光的光源用激发单色器分 光，使不同波长的入射光激发荧光体， 磷光光谱 然后让所产生的荧光通过固定波长的 要 发射单色器而照到检测器上，测定不 同波长光照射下荧光强度的变化，以 激发波长（ex)为横坐标，荧光强 200 300 400】 500 度（F)为纵坐标，可得荧光物质的 4nm 激发光谱。 复旦大学版权所有

Experimental Principle 激发光谱 荧光光谱 磷光光谱 复旦大学版权所有 5 1）激发光谱（excitation spectrum，即EX） 将激发光的光源用激发单色器分 光，使不同波长的入射光激发荧光体， 然后让所产生的荧光通过固定波长的 发射单色器而照到检测器上，测定不 同波长光照射下荧光强度的变化，以 激发波长（ λex ）为横坐标，荧光强 度（ F）为纵坐标，可得荧光物质的 激发光谱

Experimental Principle 2)发射光谱(emission spectrum,即EM) 或称荧光光谱（fluorescence spectrum) 固定激发光波长和强度，而让荧光物质发射的荧光通过 发射单色器分光扫描以检测不同波长下的荧光强度，以发射 波长（em)为横坐标，荧光强度（F)为纵坐标作图，得 到物质的荧光光谱。 激发光谱和发射光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时， 用于选择最适宜的激发波长。 复旦大学版权所有

Experimental Principle 2）发射光谱（emission spectrum，即EM） 或称荧光光谱（fluorescence spectrum） 固定激发光波长和强度，而让荧光物质发射的荧光通过 发射单色器分光扫描以检测不同波长下的荧光强度，以发射 波长（ λem ）为横坐标，荧光强度（ F）为纵坐标作图，得 到物质的荧光光谱。 激发光谱和发射光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时， 用于选择最适宜的激发波长。 复旦大学版权所有 6

Experimental Principle 102 标准曲线法 1.配制不同浓度的对照品溶液(c),测定荧光强度（F,); 2.测定空白溶剂荧光强度(F。)； 3.做F(F,F。)~C关系曲线，线性回归； 4.测定样品荧光强度F,根据（F-Fo）,求得样品浓度c。 Fx 注意：固定仪器和测定条件； 试样浓度在线性范围内 Cx 复旦大学版权所有

Experimental Principle 标准曲线法 C F      CX FX 1. 配制不同浓度的对照品溶液（cs），测定荧光强度（Fs）； 2. 测定空白溶剂荧光强度（F0）； 3. 做F （ Fs - F0 ）～C关系曲线，线性回归； 4. 测定样品荧光强度Fx，根据（ Fx - F0 ） ，求得样品浓度cx。 注意：固定仪器和测定条件； 试样浓度在线性范围内 复旦大学版权所有 7

Procedures and methods 硫酸奎宁对照溶液 移液器吸取 (50.00μg/mL） 200、400、600、800、1000uL 25.00mL 硫酸奎宁样品溶液 量瓶 移液器吸取 150μL 1、光谱扫描和定量测定； 硫酸溶液 一定容 比色血 2、空白溶剂测定； 0.05moL/L 光路 3、对照溶液线性回归， 计算样品溶液含量； 复旦大学版权所有

Procedures and methods 硫酸奎宁对照溶液 （50.00g/mL） 移液器吸取 200、400、600、800、1000L 0.05moL/L 比色皿 光路 1、光谱扫描和定量测定； 2、空白溶剂测定； 3、对照溶液线性回归， 计算样品溶液含量； 25.00mL 量瓶 硫酸溶液 定容 硫酸奎宁样品溶液 移液器吸取 150L 复旦大学版权所有 8

Procedures and methods 日立F2500荧光分光光度计操作（请结合视频） 1、荧光光谱扫描 (1)发射光谱（EM) 可选取对照溶液的母液（或是稀 释溶液的浓度最大点)，设定激 发波长365nm,设定扫描范围 280-550nm,参数2.5nm狭缝宽度 550m 和PMT400,得到发射光谱， .em-max447-449nm。 复旦大学版权所有

Procedures and methods （1）发射光谱（ EM ） 可选取对照溶液的母液（或是稀 释溶液的浓度最大点），设定激 发波长365nm，设定扫描范围 280-550nm，参数2.5nm狭缝宽度 和PMT400，得到发射光谱， λem-max 447-449nm。 日立F2500荧光分光光度计操作（请结合视频） 1、荧光光谱扫描 复旦大学版权所有 9

Procedures and methods 1936 1、荧光光谱扫描 (2)激发光谱（即EX) 硫酸童宁(E 可选取对照溶液的母液（或是 稀释溶液的浓度最大点)，设 定发射波长447-449nm,设定扫 描范围280-450nm,参数狭缝宽 度2.5nm和PMT400,得到激发 00 光谱，ex-max313、343nm。 复旦大学版权所有

复旦大学版权所有 10 （2）激发光谱（即EX） 可选取对照溶液的母液（或是 稀释溶液的浓度最大点），设 定发射波长447-449nm，设定扫 描范围280-450nm，参数狭缝宽 度2.5nm和PMT400，得到激发 光谱， λex-max 313、343nm。 1、荧光光谱扫描