复旦大学：《药物分析实验》课程教学资源（实验课件）实验3 高效液相色谱法测定血浆中氧氟沙星含量（外标法）

高效液相色谱法测定血浆中 氧氟沙星含量-外标法

高效液相色谱法测定血浆中 氧氟沙星含量-外标法

、实验目的 ■掌握高效液相色谱法的分离原理、仪器构件及使 用方法。 ■掌握生物样品前处理技术之蛋白沉淀法

一、实验目的  掌握高效液相色谱法的分离原理、仪器构件及使 用方法。  掌握生物样品前处理技术之蛋白沉淀法

实验原理 输液系统 进样和分离 检测系统 系统 数据处理和显 示系统 高压泵、进样器、色谱柱、检测器、数据处 理器和显示器

二、实验原理 高压泵、进样器、色谱柱、检测器、数据处 理器和显示器 输液系统 进样和分离 系统 检测系统 数据处理和显 示系统

二、实验原理 常见高效液相检测器类型 1.紫外检测器 2.荧光检测器 3.电化学检测器 4.示差折光检测器 5.蒸发光散射检测器 6.化学发光检测器 7.质谱检测器

1. 紫外检测器 2. 荧光检测器 3. 电化学检测器 4. 示差折光检测器 5. 蒸发光散射检测器 6. 化学发光检测器 7. 质谱检测器 二、实验原理 常见高效液相检测器类型

二、 实验原理 1.紫外检测器 >应用最广泛的检测器 >Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收， 且吸收强度与组分浓度成正比 >优点：灵敏度高，很广泛的线性范围；梯度淋洗 >缺点：对没有紫外可见波长吸收的样品无法检测； > 流动相的选择受到流动相组分对紫外可见光的吸收影响

1. 紫外检测器 应用最广泛的检测器 Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收， 且吸收强度与组分浓度成正比 优点：灵敏度高，很广泛的线性范围；梯度淋洗 缺点：对没有紫外/可见波长吸收的样品无法检测；  流动相的选择受到流动相组分对紫外可见光的吸收影响 二、实验原理

二、实验原理 2.荧光检测器 >物质的分子或原子经光照射后，有些电子被激发至较高的能级，这些电子 从高能级跃至低能级时，物质会发出比入射光波长较长的光，这种光称为荧 光。荧光检测器就是在样品的激发波长处检测发射光的强弱 >在样品浓度足够低时，荧光强度与入射光强度、量子效率及样品浓度成线 性关系 >喹诺酮类药物、芳香族化合物，如有机胺、维生素、激素、酶 >优点：非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度要比紫外检测法高2-3个数 量级。而且所需样品量很小，特别适合于药物和生物化学样品的分析 >缺点：对样品的选择性较强；其它与紫外检测器相似

2. 荧光检测器 物质的分子或原子经光照射后，有些电子被激发至较高的能级，这些电子 从高能级跃至低能级时，物质会发出比入射光波长较长的光，这种光称为荧 光。荧光检测器就是在样品的激发波长处检测发射光的强弱 在样品浓度足够低时，荧光强度与入射光强度、量子效率及样品浓度成线 性关系 喹诺酮类药物、芳香族化合物，如有机胺、维生素、激素、酶 优点：非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度要比紫外检测法高2-3个数 量级。而且所需样品量很小，特别适合于药物和生物化学样品的分析 缺点：对样品的选择性较强；其它与紫外检测器相似 二、实验原理

二、 实验原理 3.电化学检测器 >根据电化学原理和物质的电化学性质进行检测的，对具有氧化还原性质的 化合物，如含硝基、氨基等有机化合物及无机阴、阳离子等物质可采用电化 学检测器 >可分为极谱、库仑、安培和电导检测器等。 前三种统称为伏安检测器，用于具有氧化还原性质的化合物的检测， 电导检测器主要用于离子检测。 安培检测器应用较广泛，更以脉冲式安培检测器最为常用

3. 电化学检测器 根据电化学原理和物质的电化学性质进行检测的，对具有氧化还原性质的 化合物，如含硝基、氨基等有机化合物及无机阴、阳离子等物质可采用电化 学检测器 可分为极谱、库仑、安培和电导检测器等。 前三种统称为伏安检测器，用于具有氧化还原性质的化合物的检测， 电导检测器主要用于离子检测。 安培检测器应用较广泛，更以脉冲式安培检测器最为常用 二、实验原理

二、实验原理 4.示差折光检测器 >基于样品组分的折射率与流动相溶剂折射率有差异，当组分洗 脱出来时，会引起流动相折射率的变化，这种变化与样品组分的 浓度成正比 >对于那些无紫外吸收的有机物（如高分子化合物、糖类、脂肪 烷烃)是比较适合的。在凝胶色谱中是必备检测器，在制备色谱 中也经常使用 >缺点：灵敏度很低；不能用于梯度洗脱系统

4. 示差折光检测器 基于样品组分的折射率与流动相溶剂折射率有差异，当组分洗 脱出来时，会引起流动相折射率的变化，这种变化与样品组分的 浓度成正比 对于那些无紫外吸收的有机物（如高分子化合物、糖类、脂肪 烷烃）是比较适合的。在凝胶色谱中是必备检测器，在制备色谱 中也经常使用 缺点：灵敏度很低；不能用于梯度洗脱系统 二、实验原理

二、 实验原理 5.蒸发光散射检测器 >基于溶质的光散射性质 >色谱柱流出液进入雾化器形成微小液滴，与通入的气体（通常是氮气，有 时也用空气)混合均匀，经过加热的漂移管，蒸发除去流动相 >能检测不含发色团的化合物，如：碳水化合物、脂类、聚合物、未衍生脂 肪酸和氨基酸、表面活性剂、药物，并在没有标准品和化合物结构参数未知 的情况下检测未知化合物 >响应不依赖于样品的光学特性，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测， 不受其官能团的影响 >响应值与样品的质量成正比，因而能用于测定样品的纯度或者检测未知物

5. 蒸发光散射检测器 基于溶质的光散射性质 色谱柱流出液进入雾化器形成微小液滴，与通入的气体 （通常是氮气，有 时也用空气）混合均匀，经过加热的漂移管，蒸发除去流动相 能检测不含发色团的化合物，如：碳水化合物、脂类、聚合物、未衍生脂 肪酸和氨基酸、表面活性剂、药物，并在没有标准品和化合物结构参数未知 的情况下检测未知化合物 响应不依赖于样品的光学特性，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测， 不受其官能团的影响 响应值与样品的质量成正比，因而能用于测定样品的纯度或者检测未知物 二、实验原理

二、实验原理 6.化学发光检测器 >基于某些物质在常温下进行化学反应，生成处于激发态势反应中间体或反 应产物，当它们从激发态返回基态时，就会发射出光子。由于物质激发态的 能量是来自化学反应，所以叫做化学发光 >当分离组分从色谱柱中洗脱出来后，立即与适当的化学发光试剂混合，引 起化学反应，导致发光物质产生辐射，其光强度与该物质的浓度成正比 >优点：快速、灵敏、设备简单、价廉、线性范围宽

6. 化学发光检测器 基于某些物质在常温下进行化学反应，生成处于激发态势反应中间体或反 应产物，当它们从激发态返回基态时，就会发射出光子。由于物质激发态的 能量是来自化学反应，所以叫做化学发光 当分离组分从色谱柱中洗脱出来后，立即与适当的化学发光试剂混合，引 起化学反应，导致发光物质产生辐射，其光强度与该物质的浓度成正比 优点：快速、灵敏、设备简单、价廉、线性范围宽 二、实验原理