《生物化学与分子生物学》课程教学课件（实验讲稿）双缩脲法测定蛋白质的浓度

实验一双缩腺法测定蛋白质的浓度OHC端N端CHsCHsCHCH2CHOHCHa日HCH2H.NNCOO1HHPHAmino-Carboxyl-terminal endterminal end

实验一 双缩脲法测定蛋白质的浓度 N 端 C 端

相关知识目前常用的有四种经典方法：凯氏定氮法：灵敏度0.2~1.0mg双缩脲法（Biuret法）：0.5mg/mlFolin一酚试剂法（Lowry法）：50~100μg紫外吸收法：5μg考马斯亮蓝法（Bradford法）：1~5μg

相关知识 目前常用的有四种经典方法： 凯氏定氮法：灵敏度0.2~1.0mg 双缩脲法（Biuret法）：0.5 mg/ml Folin－酚试剂法（Lowry法）：50~100μg 紫外吸收法：5μg 考马斯亮蓝法（Bradford法）：1~5μg

实验目的：一1掌握双缩脲法定量蛋白质的操作方法和原理2学会制作及使用标准曲线

一、实验目的： 1 掌握双缩脲法定量蛋白质的操作方法和原理。 2 学会制作及使用标准曲线

实验原理：1、双缩脲反应双缩脲反应：双缩脲在碱性溶液中与Cu2+结合生成紫色配合物，这一呈色反应称为双缩脲反应

二、实验原理： 1、双缩脲反应 双缩脲反应：双缩脲在碱性溶液中与Cu2+结 合生成紫色配合物，这一呈色反应称为双缩脲 反应

双缩脲反应将尿素加热，两分子尿素放出一分子氨而形成双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)。NHNH门1800NHNHH-N加热NHORNHNH双缩脲HHHN=0OH+Cu2+HNNHNH碱性环境=00NHH

双缩脲反应 加热 ＋ NH3 2 2 H－ 1800 双缩脲 2 2 2 2 2 将尿素加热，两分子尿素放出一分子氨而形成双缩脲 （NH2-CO-NH-CO-NH2）。 碱性环境

蛋白质的双缩脲反应：00HC=OH多肽、蛋白质含有两个以上的肽CHRR-CH键（与双缩中亚酰胺键相似），=O因此有双缩脲反0=CHH应。NNCH-RRCHH.O11

蛋白质的双缩脲反应: 多肽、蛋白质含 有两个以上的肽 键（与双缩脲中 亚酰胺键相似）， 因此有双缩脲反 应

」在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关，因此被广泛地应用。I除一CONH一有此反应外，一CONH一，一CH2NH2，一CS一NH2等亦有此反应

l 在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合 物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比， 而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关，因 此被广泛地应用。 l 除－CONH－有此反应外，－CONH2－，－CH2－ NH2，－CS－NH2等亦有此反应

0.60.50.4.Ar0.20. 1Cx04610c(mg/mL2c标准曲线2.标准曲线法配制一系列浓度由小到大的标准溶液，测出它们的吸光度。以各标准溶液的浓度为横坐标，相应的吸光度为纵坐标在方格坐标纸上绘出标准曲线。相同条件测出待测样品的吸光度后，从标准曲线上可以直接查出其浓度。分析大批样品时，通常采用此法

2.标准曲线法 c(mg/mL ) Ax Cx 配制一系列浓度由小到大的标准溶液，测出它们的吸光 度。以各标准溶液的浓度为横坐标，相应的吸光度为纵坐标， 在方格坐标纸上绘出标准曲线。相同条件测出待测样品的吸 光度后，从标准曲线上可以直接查出其浓度。分析大批样品 时，通常采用此法

三、实验操作步骤1、标准曲线的绘制及待测液浓度测定（5mg/ml）57123468试剂（ml)1.22.00.40.81.6蛋白标准液待测样品液1.01.0蒸馏水2.01.61.20.80.41.01.04.04.04.04.04.04.04.04.0双缩脲试剂2、室温30min，540nm比色。3、计算未知样本品浓度

三、实验操作步骤 1、标准曲线的绘制及待测液浓度测定(5mg/ml) 试剂（ml） 1 2 3 4 5 6 7 8 蛋白标准液 — 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 — — 待测样品液 — — — — — — 1.0 1.0 蒸馏水 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 — 1.0 1.0 双缩脲试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 2、室温30min，540nm比色。 3、计算未知样本品浓度

本实验圾质量摘横燃标：A0.60. 50. 40. 30. 20. 101/32/3M0(mg)c标准曲线

c(mg/mL) 1/3 2/3 M (mg) 如果以浓度为横坐标： 本实验以质量为横坐标：