《生物化学与分子生物学》课程教学课件（实验讲稿）血浆清蛋白分离纯化的鉴定

血浆清蛋白分离纯化的鉴定生化与分生教研室

生化与分生教研室 血浆清蛋白分离纯化的鉴定

实验目的：1、掌握血浆蛋白质醋酸纤维薄膜电泳的原理2、学习醋酸纤维薄膜电泳的操作方法

实验目的： 1、掌握血浆蛋白质醋酸纤维薄膜电泳的原理。 2、学习醋酸纤维薄膜电泳的操作方法

实验原理电泳是指带电颗粒在电场中向着与其电性相O反的电极移动的现象

实验原理 o 电泳是指带电颗粒在电场中向着与其电性相 反的电极移动的现象

实验方法准备电泳槽：电泳槽内放入巴比妥缓冲液电泳槽应密闭使蒸汽饱和，避免水分蒸发配图

o 准备电泳槽：电泳槽内放入巴比妥缓冲液， 电泳槽应密闭使蒸汽饱和，避免水分蒸发。 配图 实验方法

浸膜：将醋酸纤维薄膜膜面朝下，置于pH8.6巴比妥缓冲液中，直至浸膜完全加样电泳染色与漂洗

o 浸膜：将醋酸纤维薄膜膜面朝下，置于 pH8.6巴比妥缓冲液中，直至浸膜完全。 o 加样 o 电泳 o 染色与漂洗

(1)(3)(4)(5)(2)000000C0硫酸铵000000boo000aO00C0000000Q006oo2Q000DC00凝胶颗粒000000000000000000000000000多孔板清蛋白006A000B00清蛋白硫酸铵+磺基水杨酸十奈氏试剂白色浑黄色浊沉淀

硫酸铵 清蛋白 清蛋白 硫酸铵 白色浑 浊沉淀 黄色 +磺基水杨酸 +奈氏试剂

实验方法析1.在一支3mL塑料离心管中加入1mL血浆，再加入1mL饱和硫酸铵溶液，边滴加边搅拌。加完后4℃静置10分钟，使之充分盐析，然后以6000g离心5分钟。此时的上清液中含有清蛋白，沉淀为球蛋白。2.将上清液全部吸至另一支干净离心管中

实验方法 o 一、盐析 1．在一支3 mL塑料离心管中加入1 mL血浆，再加入1 mL饱和硫酸铵溶液，边滴加边搅拌。加完后4℃静置 10分钟，使之充分盐析，然后以6000 g离心5分钟。 此时的上清液中含有清蛋白，沉淀为球蛋白。 2．将上清液全部吸至另一支干净离心管中

二、凝胶层析O1凝胶的准备葡聚糖凝胶是粉未状，使用前需要充分的溶胀。称营取SephadexG-501.0g，加去离子水30mL，室温溶胀3小时以上。2装柱取层析柱一支，用去离子水将层析柱烧结板下端的死区充满，不得留有气泡，关闭层析柱的出口。将已经溶胀好的凝胶悬液沿玻棒小心地慢慢灌入柱中，待底部凝胶沉积1一2cm时，打开出口，继续加入凝胶悬液直到凝胶层积集至约14～15cm即可。凝胶悬液尽量一次性加完，避免出现不均匀或分层的凝胶带。如表层凝胶凸凹不平，可用玻棒轻轻搅动，使凝胶自然沉降，使其表面平整。3.加样与洗脱加样时先将层析柱的出口打开，让去离子水缓缓流出，待床面上仅留下极薄的一层去离子水时，关闭出口。使用滴管将含清蛋白的混合溶液小心地加到凝胶床的表面。注意加样时不要将床面冲起，也不要沿柱壁加入。加入后，打开出口，使加好的样品恰好进入床面（注意不要让空气进入床内），再用以上方法滴加1～2倍样品体积的去离子水，待样品完全流进床内，加去离子水进行扩展洗脱然后准备收集蛋白质

o 二、凝胶层析 o 1．凝胶的准备 葡聚糖凝胶是粉末状，使用前需要充分的溶胀。称 取Sephadex G-50 l.0 g，加去离子水30 mL，室温溶胀3小时以上。 o 2．装柱 取层析柱一支，用去离子水将层析柱烧结板下端的死区充 满，不得留有气泡，关闭层析柱的出口。将已经溶胀好的凝胶悬液沿 玻棒小心地慢慢灌入柱中，待底部凝胶沉积1～2 cm时，打开出口， 继续加入凝胶悬液直到凝胶层积集至约14～15 cm即可。凝胶悬液尽 量一次性加完，避免出现不均匀或分层的凝胶带。如表层凝胶凸凹不 平，可用玻棒轻轻搅动，使凝胶自然沉降，使其表面平整。 o 3．加样与洗脱 加样时先将层析柱的出口打开，让去离子水缓缓流 出，待床面上仅留下极薄的一层去离子水时，关闭出口。使用滴管将 含清蛋白的混合溶液小心地加到凝胶床的表面。注意加样时不要将床 面冲起，也不要沿柱壁加入。加入后，打开出口，使加好的样品恰好 进入床面（注意不要让空气进入床内），再用以上方法滴加1～2倍样 品体积的去离子水，待样品完全流进床内，加去离子水进行扩展洗脱， 然后准备收集蛋白质

4.蛋白质的收集洗脱开始时，用量筒收集洗脱液，收集约4mL后（凝胶柱高约14cm时）用20%磺基水杨酸溶液检测清蛋白。具体方法为：在小试管中加入20%磺基水杨酸溶液2滴，接下来在小试管中再接一滴洗脱液，如出现白色混浊或沉淀即表示有蛋自质析出。此时，用1.5mL离心管收集洗脱液，每管1mL。从第3支Ep管开始，用20%磺基水杨酸溶液检测蛋白质，与此同时，用奈氏试剂检测NH4+。如果奈氏试剂显黄色，说明已有NH4+流出，则弃去该管：如没有NH4+，有蛋白质则继续收集。合并含蛋白质，且无NH4+的各管，混匀。5.浓缩清蛋白在含有清蛋白的Ep管中，按每毫升加入0.2~0.25gSephadexG-25干胶，摇动2~3分钟，3000g离心5分钟上清液即为浓缩的清蛋白溶液。收集上清，置于-20°C保存，用于鉴定。6.回收Sephadex当蛋白质全部流出后，继续是用去离子水洗脱层析柱，洗脱大约30mL去离子水时，在白磁盘中滴加1滴奈氏试剂，检测洗脱液中是否含有NH4+。待NH4+全部流出后，回收SephadexG-50

o 4．蛋白质的收集 洗脱开始时，用量筒收集洗脱液，收集约4 mL后（凝胶柱高约14 cm时）用20%磺基水杨酸溶液检测清蛋白。 具体方法为：在小试管中加入20%磺基水杨酸溶液2滴，接下来在 小试管中再接一滴洗脱液，如出现白色混浊或沉淀即表示有蛋白 质析出。此时，用1.5 mL离心管收集洗脱液，每管1 mL。从第3 支Ep管开始，用20%磺基水杨酸溶液检测蛋白质，与此同时，用 奈氏试剂检测NH4+。如果奈氏试剂显黄色，说明已有NH4+流出， 则弃去该管；如没有NH4+，有蛋白质则继续收集。合并含蛋白质， 且无NH4+的各管，混匀。 o 5．浓缩清蛋白 在含有清蛋白的Ep管中，按每毫升加入0.2～ 0.25 g Sephadex G-25干胶，摇动2～3分钟，3000 g离心5分钟。 上清液即为浓缩的清蛋白溶液。收集上清，置于-20°C保存，用 于鉴定。 o 6．回收Sephadex 当蛋白质全部流出后，继续是用去离子水洗 脱层析柱，洗脱大约30 mL去离子水时，在白磁盘中滴加1滴奈氏 试剂，检测洗脱液中是否含有NH4+。待NH4+全部流出后，回收 SephadexG-50

注意事项盐析时，一搅拌时不要过急，以免产生过多泡沫，使蛋白质变性凝胶溶胀必须彻底，否则影响层析的均一2、性，甚至可导致层析柱破裂3、凝胶装柱过程中严防出现气泡和分层，要使液面始终高于床面，以免气体进入柱床而导致干裂现象。4、上样速度与洗脱速度要一致。否则导致样5、加样时尽量避免样品被稀释，品扩散

注意事项 o 1、盐析时，搅拌时不要过急，以免产生过多 泡沫，使蛋白质变性。 o 2、凝胶溶胀必须彻底，否则影响层析的均一 性，甚至可导致层析柱破裂。 o 3、凝胶装柱过程中严防出现气泡和分层，要 使液面始终高于床面，以免气体进入柱床而 导致干裂现象。 o 4、上样速度与洗脱速度要一致。 o 5、加样时尽量避免样品被稀释，否则导致样 品扩散