《生物化学与分子生物学》课程教学课件（实验讲稿）血浆清蛋白分离纯化

血浆清蛋白分离纯化筛板生化与分生教研室李嘉欣样本凝胶加样收集不同组分

血浆清蛋白分离纯化 生化与分生教研室 李嘉欣

分离得到高纯度并具有生物学活性的自的蛋白是研究蛋白质结构和功能的基础，也是生物化学与分子生物学技术的重要组成部分。分离纯化原则1、样本的选择：选择稳定性强、含量高、来源广、数量足且成本低的蛋白质样本。还要考虑目的蛋白在细胞中的分布。2、目的蛋白信息的掌握：如了解等电点、分子量、胶体性质和稳定性等根据终产品的用途选择，并3、纯化过程的选择：综合考虑纯化产品的质量、数量和经济性等

分离得到高纯度并具有生物学活性的目的蛋白是研究蛋白质结构 和功能的基础，也是生物化学与分子生物学技术的重要组成部分。 分离纯化原则 1、样本的选择：选择稳定性强、含量高、来源广、 数量足且成本低的蛋白质样本。还要考虑目的蛋白 在细胞中的分布。 2、目的蛋白信息的掌握：如了解等电点、分子量、 胶体性质和稳定性等。 3、纯化过程的选择：根据终产品的用途选择，并 综合考虑纯化产品的质量、数量和经济性等

分离纯化方法1、初级分离-沉淀法：：将目的蛋白与其他杂质蛋白分离。常用沉淀分离方法，如盐析法、有机溶剂沉淀法和等电点沉淀法。2、高级分离：根据目的蛋白质纯化度的要求，采用层析（凝胶层析、分配层析、吸附层析、离子交换层析和亲和层析等）和电泳大（醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等）等方法进一步纯化

分离纯化方法 1、初级分离-沉淀法：将目的蛋白与其他杂质蛋白分离。 常用沉淀分离方法，如盐析法、有机溶剂沉淀法和等电点 沉淀法。 2、高级分离：根据目的蛋白质纯化度的要求，采用层析 （凝胶层析、分配层析、吸附层析、离子交换层析和亲和 层析等）和电泳（醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳和 聚丙烯酰胺凝胶电泳等）等方法进一步纯化

定量和定性分析·定量分析：凯氏定氮法、双缩脲法、Foloin-酚试剂法、考马斯亮蓝法等。·定性分析：等电聚焦电泳、SDS-PAGE、Westernblotting等。蛋白质的鉴定免疫印迹、质谱分析

• 定量分析：凯氏定氮法、双缩脲法、Foloin-酚试剂 法、考马斯亮蓝法等。 • 定性分析：等电聚焦电泳、SDS-PAGE、Western blotting等。 定量和定性分析 蛋白质的鉴定 • 免疫印迹、质谱分析

实验目的：n1、学习利用盐析法分离血浆清蛋白的实验方法。n2、掌握盐析法的基本原理n3、掌握凝胶层析技术的基本原理n4、熟悉凝胶层析技术的实验方法

实验目的： n 1、学习利用盐析法分离血浆清蛋白的实验 方法。 n 2、掌握盐析法的基本原理。 n 3、掌握凝胶层析技术的基本原理。 n 4、熟悉凝胶层析技术的实验方法

实验原理n一、粗分离一盐析法盐析：指向蛋白质溶液中加入某些高浓度的无机盐溶液后是蛋白质的溶解度降低，进而使蛋白质凝聚从溶液中析出。蛋白质溶液是稳定的亲水胶体溶液维持稳定性的因素半饱和硫酸铵溶液中：血浆中球蛋白析出饱和硫酸铵溶液：球蛋水斑和清蛋白都析出。离子强度改变对水分子亲和力+中性盐溶液中和表面电荷大于蛋白质，破坏水化膜蛋白质溶解度降低，分子聚集沉淀

实验原理 n 一、粗分离—盐析法 ￾￾￾盐析：指向蛋白质溶液中加入某些高浓度的无机盐溶液后， 是蛋白质的溶解度降低，进而使蛋白质凝聚从溶液中析出。 蛋白质溶液是稳定的亲水胶体溶液 维持稳定性的因素 分子表面电荷 水化膜 +中性盐溶液 离子强度改变， 中和表面电荷 对水分子亲和力 大于蛋白质，破 坏水化膜 蛋白质溶解度降低，分子聚集沉淀 半饱和硫酸铵溶液中：血浆中球蛋白析出 饱和硫酸铵溶液中：球蛋白和清蛋白都析出

二、细分离一凝胶层析（分子筛层析）按分子大小分离样品中各组分的一种物理分离方法。混合物通过凝胶时，由于分子大小不同，通过凝胶柱的速度不同，得以分离。n 分子筛效应：移动速①小分子物质：流程长、易进入凝胶网孔，度慢。①大分子物质：不能进入凝胶网孔，沿凝胶颗粒间流动，流程短、移动快

二、细分离—凝胶层析（分子筛层析） n 分子筛效应： Ø 小分子物质：易进入凝胶网孔，流程长、移动速 度慢。 Ø 大分子物质：不能进入凝胶网孔，沿凝胶颗粒间 流动，流程短、移动快。 按分子大小分离样品中各组分的一种物理分离方法。混合 物通过凝胶时，由于分子大小不同，通过凝胶柱的速度不 同，得以分离

(1)(3)(4)(5)R000000C0硫酸铵00060oboo000600CO000000000600000QQO00DO00凝000000000菜胶颗粒00000000000000000多孔板清蛋白00SA401B0a清蛋白硫酸铵+磺基水杨酸+奈氏试剂白色浑黄色浊沉淀

硫酸铵 清蛋白 清蛋白 硫酸铵 白色浑 浊沉淀 黄色 +磺基水杨酸 +奈氏试剂

实验方法n一、盐析1在一支1.5mL塑料离心管中加入0.5mL血浆，再加入0.5mL饱和硫酸铵溶液，轻轻摇晃。加完后静置10分钟，使之充分盐析，然后以6000g离心5分钟。此时的上清液中含有清蛋白，沉淀为球蛋白。2．上清液用于加样

实验方法 n 一、盐析 1．在一支1.5mL塑料离心管中加入0.5 mL血浆，再 加入0.5mL饱和硫酸铵溶液，轻轻摇晃。加完后静 置10分钟，使之充分盐析，然后以6000 g离心5分 钟。此时的上清液中含有清蛋白，沉淀为球蛋白。 2．上清液用于加样

n二、凝胶层析1，凝胶的准备，装柱略。n2.加样与洗脱加样时先将层析柱的出口打开，让去离子水缓缓流出，待床面上仅留下极薄的一层去离子水时，关闭出口。使用滴管将含清蛋白的混合溶液小心地加到凝胶床的表面。注意加样时不要将床面冲起，也不要沿柱壁加入。加入后，打开出口，使加好的样品恰好进入床面（注意不要让空气进入床内），再用以上方法滴加1～2倍样品体积的去离子水，待样品完全流进床内，加去离子水进行扩展洗脱，然后准备收集蛋白质。n3.蛋白质的收集洗脱开始时，用量筒收集洗脱液，收集约4mL后（凝胶柱高约14cm时）用20%磺基水杨酸溶液检测清蛋白。具体方法为：在小试管中加入20%磺基水杨酸溶液2滴，接下来在小试管中再接一滴洗脱液，如出现白色混浊或沉淀即表示有蛋白质析出。此时，用1.5mL离心管收集洗脱液1m。约半小时（20m1洗脱液）在白磁盘中滴加1滴奈氏试剂，检测洗脱液中是否含有NH4+。如果奈氏试剂显黄色，说明已有NH4+流出，待NH4+全部流出后，回收SephadexG-50。n4．浓缩清蛋白在含有清蛋白的Ep管中，按每毫升加入0.1gSephadexG-50干胶，摇动2～3分钟，3000g离心5分钟。上清液即为浓缩的清蛋白溶液。收集上清，置于-20°C保存，用于鉴定

n 二、凝胶层析 1．凝胶的准备，装柱略。 n 2．加样与洗脱￾￾￾￾加样时先将层析柱的出口打开，让去离子水缓缓流出，待床面上仅留下极薄 的一层去离子水时，关闭出口。使用滴管将含清蛋白的混合溶液小心地加到凝胶床的表面。 注意加样时不要将床面冲起，也不要沿柱壁加入。加入后，打开出口，使加好的样品恰好进 入床面（注意不要让空气进入床内），再用以上方法滴加1～2倍样品体积的去离子水，待样 品完全流进床内，加去离子水进行扩展洗脱，然后准备收集蛋白质。 n 3．蛋白质的收集￾￾￾￾洗脱开始时，用量筒收集洗脱液，收集约4 mL后（凝胶柱高约14 cm时） 用20%磺基水杨酸溶液检测清蛋白。具体方法为：在小试管中加入20%磺基水杨酸溶液2滴，接 下来在小试管中再接一滴洗脱液，如出现白色混浊或沉淀即表示有蛋白质析出。此时，用1.5 mL离心管收集洗脱液1 mL。约半小时(20ml洗脱液)在白磁盘中滴加1滴奈氏试剂，检测洗脱液 中是否含有NH4+。如果奈氏试剂显黄色，说明已有NH4+流出，待NH4+全部流出后，回收 SephadexG-50。 n 4．浓缩清蛋白￾￾￾￾在含有清蛋白的Ep管中，按每毫升加入0.1g Sephadex G-50干胶，摇动2～3 分钟，3000 g离心5分钟。上清液即为浓缩的清蛋白溶液。收集上清，置于-20°C保存，用于 鉴定