《动物微生物与免疫学》课程教学资源（讲稿）第八章 免疫检测

第九章免疫检测(监测)一、定义：利用免疫学的测定方法对动物的免疫功能和某些疾病进行测定和诊断。又称免疫学诊断。二、应用1.用已知的抗原测定未知抗体或致敏LC1）活畜的检疫（主要是结核），主要用于传染病2）免疫水平的测定3）疫苗的效果考核4）血清流行病学调查5）快速诊断2.用已知的抗体测未知抗原1）传染病的诊断2）病原的鉴定3）抗原的提纯4）抗原定位检查5）动物体生物活性物质测定，包括激素，微量药物，在兽医上主要用母畜的早期妊娠诊断等3.免疫功能的测定1）体液免疫：BC抗体水平2）细胞免疫：TC，K，NK，巨噬C三、分类体液体外监测、细胞体液体内监测+细胞四、免疫检测方法的要求1.特异性强：尽量减少交叉反应2.灵敏度高：微量抗原，抗体3.操作要简便：不需特殊设备，易于推广4.阴性和阳性对照（特异性高，准确性高，但灵敏度低，灵敏度高，但需特殊设备则不能同时满足三条件）

第九章 免疫检测(监测) 一、定义：利用免疫学的测定方法对动物的免疫功能和某些疾病进行测定和 诊断。又称免疫学诊断。 二、应用 1．用已知的抗原测定未知抗体或致敏 LC 1) 活畜的检疫(主要是结核)，主要用于传染病 2) 免疫水平的测定 3) 疫苗的效果考核 4) 血清流行病学调查 5) 快速诊断 2．用已知的抗体测未知抗原 1) 传染病的诊断 2) 病原的鉴定 3) 抗原的提纯 4) 抗原定位检查 5) 动物体生物活性物质测定，包括激素，微量药物，在兽医上主要用母畜 的早期妊娠诊断等 3．免疫功能的测定 1) 体液免疫：BC 抗体水平 2) 细胞免疫：TC，K，NK，巨噬 C 三、分类 体液 体外监测 细胞 体液 体内监测 细胞 四、免疫检测方法的要求 1． 特异性强：尽量减少交叉反应 2． 灵敏度高：微量抗原，抗体 3． 操作要简便：不需特殊设备，易于推广 4． 阴性和阳性对照 （特异性高，准确性高，但灵敏度低，灵敏度高，但需特殊设备则不能同时 满足三条件）

第一节体外体液测定方法一血清学试验技术（新书第24章）1.．血清学反应：以血清中抗体为被测定对象或诊断试剂而进行的体外的体液的抗原抗体反应抗原与抗体的结合力：抗原与抗体结合是通过以下形式结合的（1）静电力作用：由抗原与抗体上带的阳性电荷和阴性电荷互相吸引面结合(1)氢键结合作用：由Ag和Ab分子上的亲水基因互相结合(2）疏水相互作用：当抗原抗体分表面的疏水基因互相吸引而发生结合(3）范德华力：由Ab和Ag分子外层电之间的吸引而发生结合2.抗原抗体结合特征1）高度特异性与可可逆性(Ab和Ag可特异性结合，但也以发生离解，即结合后不久可脱离因此与在观察结果时要一定时内完成否则造成不足现象而出现阴性结果）2）最适比与带现象最适比：当抗原抗体比例适当才可见的现象带现象：抗原或抗体不足（Ab和Ag两者只有在比例适当时才出现可见反应，否则未结合的抗体或抗原游离于上清液中，不能形成大块复合物，因而不出现可见反应，这种现象称为带现象。抗体过剩一前带现象，抗原过剩一后带现象3）反应的阶段性可分为两个阶段，第一阶段为Ab和Ag的特异性结合阶段，反应快，但不出现肉眼可见现象。第二阶段称为Ab和Ag的可见阶段，当Ab和Ag结合后在电介质，温度，PH，补体等影响下，发生肉眼可见凝集，沉淀，溶解，吸收，补体结合等反应，主要反应较慢，需几分钟甚至几十分钟或更久。3.影响抗原抗体反应的因素1)温度，一般37度2)PH值中性6.4~7.63)电解质液：大多数AgAb反应都需一定浓度电解液（等渗液），生理盐水，PBS4)振荡与混合4.血清学试验中抗原，抗体浓度（含量）的表示方法效价（毒价、凝集价，中和价）都指出现明显反应终点的抗原或血清的最高的稀释倍数

第一节 体外体液测定方法——血清学试验技术（新书第 24 章） 1． 血清学反应：以血清中抗体为被测定对象或诊断试剂而进行的体外 的体液的抗原抗体反应 抗原与抗体的结合力：抗原与抗体结合是通过以下形式结合的 (1)静电力作用：由抗原与抗体上带的阳性电荷和阴性电荷互相吸引面结合 (1) 氢键结合作用：由 Ag 和 Ab 分子上的亲水基因互相结合 (2) 疏水相互作用：当抗原抗体分表面的疏水基因互相吸引而发生结合 (3) 范德华力：由 Ab 和 Ag 分子外层电之间的吸引而发生结合 2． 抗原抗体结合特征 1） 高度特异性与可可逆性(Ab 和 Ag 可特异性结合，但也以发生离解， 即结合后不久可脱离因此与在观察结果时要一定时内完成否则造成不足现象而 出现阴性结果) 2） 最适比与带现象 最适比：当抗原抗体比例适当才可见的现象 带现象：抗原或抗体不足（Ab 和 Ag 两者只有在比例适当时才出现可见反 应，否则未结合的抗体或抗原游离于上清液中，不能形成大块复合物，因而不出 现可见反应，这种现象称为带现象。 抗体过剩——前带现象，抗原过剩——后带现象 3） 反应的阶段性 可分为两个阶段，第一阶段为 Ab 和 Ag 的特异性结合阶段，反应快，但不 出现肉眼可见现象。第二阶段称为 Ab 和 Ag 的可见阶段，当 Ab 和 Ag 结合后在 电介质，温度，PH，补体等影响下，发生肉眼可见凝集，沉淀，溶解，吸收， 补体结合等反应，主要反应较慢，需几分钟甚至几十分钟或更久。 3． 影响抗原抗体反应的因素 1） 温度，一般 37 度 2） PH 值 中性 6.4~7.6 3） 电解质液：大多数 Ag Ab 反应都需一定浓度电解液（等渗液），生理 盐水，PBS 4） 振荡与混合 4． 血清学试验中抗原，抗体浓度（含量）的表示方法 效价（毒价、凝集价，中和价）都指出现明显反应终点的抗原或血清的最高 的稀释倍数

（一）凝集反应颗粒性抗原与相应的抗体结合在适量电解质存在下，经过一定时间出现肉眼可见的凝集块，这种反应叫～凝集：抗原一凝集原，抗体凝集素颗粒性抗原：大分子抗原，病毒颗粒，原虫虫体1.直接凝集反应颗粒性抗原与相应抗体直接结合出现可见反应1）平板凝集反应：抗原或抗体的定性（1）已知抗原查未知抗体大群检疫，布病，鸡白痢，鸡霉形体感染（2）已知抗体测未知的细菌优点：操作简便用于大群检疫灵敏度不高，检出率低2）试管凝集反应：抗体的定性和定量（效价）抗原与抗体在含有电解质液的试管中的反应（如兽医上常用布氏杆菌试管凝集反应，是布病检疫的常用方法。间接凝集反应2.将不溶性抗原先吸附在一种与免疫无关的大分子物体上（载体）就变为颗粒性Ag后与相应Ab结合出现可见的凝集块。（这种反应由于使分散的抗原吸附在载体颗粒上，将沉淀反应转化为凝集反应，当载体颗粒上的抗原与微量抗体结合后，就足出现肉眼可见的反应，提高了反应的敏感性。常用载体：红C（绵羊红细胞，人O型），聚苯乙烯乳胶，活性碳分别称之为：间接血凝，乳胶凝集试验，碳素凝集试验1）正向间接凝集反应（即间接凝集反应）已知Ag吸附在载体表面，测定未知抗体（1）间接血凝试验（HA)：可溶性Ag+红C—颗粒性Ag+Ab用绵羊红细胞作为载体，吸时可溶性抗原形成致敏红细胞。一般多糖抗原可直接吸吋于红细胞表面，而蛋白质抗原则需借助于化学媒介物偶联于红细胞上，常用方法有酸处理法，戊二醛法等方法：红细胞（甲醛，成二醛，醛化）酸化+可溶性Ag（敏化）诊断抗原血球（敏化血球）+Ab一血凝反应特点：操作简便敏感性特异性高主要用于某些传染病和寄生虫病的诊断（猪瘟，羊衣原体，弓形体，锥虫病羊多头蝴，棘球，旋毛虫）（2）乳胶凝集试验

（一） 凝集反应 颗粒性抗原与相应的抗体结合在适量电解质存在下，经过一定时间出现肉眼 可见的凝集块，这种反应叫~ 凝集：抗原——凝集原，抗体——凝集素 颗粒性抗原：大分子抗原，病毒颗粒，原虫虫体 1． 直接凝集反应 颗粒性抗原与相应抗体直接结合出现可见反应 1） 平板凝集反应：抗原或抗体的定性 （1）已知抗原查未知抗体大群检疫，布病，鸡白痢，鸡霉形体感染（2）已知抗 体测未知的细菌 优点：操作简便用于大群检疫 灵敏度不高，检出率低 2） 试管凝集反应：抗体的定性和定量（效价） 抗原与抗体在含有电解质液的试管中的反应(如兽医上常用布氏杆菌试管凝 集反应，是布病检疫的常用方法。 2． 间接凝集反应 将不溶性抗原先吸附在一种与免疫无关的大分子物体上（载体）就变为颗 粒性 Ag 后与相应 Ab 结合出现可见的凝集块。(这种反应由于使分散的抗原吸附 在载体颗粒上，将沉淀反应转化为凝集反应，当载体颗粒上的抗原与微量抗体结 合后，就足出现肉眼可见的反应，提高了反应的敏感性。 常用载体：红 C（绵羊红细胞，人 O 型），聚苯乙烯乳胶，活性碳 分别称之为：间接血凝，乳胶凝集试验，碳素凝集试验 1） 正向间接凝集反应（即间接凝集反应） 已知 Ag 吸附在载体表面，测定未知抗体 （1） 间接血凝试验（HA）：可溶性 Ag+红 C——颗粒性 Ag+Ab 用绵羊红细胞作为载体，吸咐可溶性抗原形成致敏红细胞。一般多糖抗原可 直接吸咐于红细胞表面，而蛋白质抗原则需借助于化学媒介物偶联于红细胞上， 常用方法有鞣酸处理法，戊二醛法等 方法：红细胞（甲醛，成二醛，醛化）鞣酸鞣化+可溶性 Ag（敏化） 诊断抗原血球（敏化血球）+Ab——血凝反应 特点：操作简便敏感性特异性高 主要用于某些传染病和寄生虫病的诊断（猪瘟，羊衣原体，弓形体，锥虫病， 羊多头蚴，棘球蚴，旋毛虫） （2） 乳胶凝集试验

可溶性Ag+乳胶——颗粒性Ag+Ab2）反向间接凝集反应可溶性Ab+载体——颗粒性Ab+Ag测某些小分子可溶性Ag，人主要测乙肝Ag3）协同凝集反应抗体+SPA一诊断用SPAAB+未知细菌一凝集反应用于未知菌的鉴定原理：金黄色葡萄球菌细胞壁上的A蛋白(SPA)，具有和大多数哺乳动物IgG的Fc段发生非特异性结合特性，而IgG的Fab段则与特异性抗原结合，当标记的SPA上的IgG与抗原相见时，则IgG，Fab段与抗原结合，从而起到协同凝集作用，它的特点是即保持SPA标记抗体的方法，对应提高抗体的敏感性。含A蛋白的金黄色葡萄球菌在反应中起到载体和“放大的作用。血凝与血凝抑制反应（HA—HI试验）原理：微生物可凝集某些动物的红C出现HA反应，当加入相应抗体时就出现不凝集（HI抑制微生物对红C的凝集）现象（某些微生物能凝集哺乳动物和禽类的红细胞而针对这种微生物的抗体能抑制近种血凝反应，前者称血凝反应，后者称血凝抑制反应）应用：（1）用已知AB测未知病毒，诊断传染病ND（2）用已知病毒测血清中AB含量，监测动物免疫水平及早期诊断方法：常用B——微量法，——固定病毒稀释血清法(另少用固定血清稀释)步骤：（1）先测定病毒的HA效价：稀释病毒十红C一一血凝（2）（以NDV为例）用已知4单位的病毒十稀释血清十红C一一有无凝集体（以完全抑制V血凝反应的血清最高稀释度的倒数来表示抗体的HI效价，如1：256，Log8)注意问题：1)作HI试验时（包括间接血凝试验）一定掌握判定时间和温度，一般以室温20~30分钟，4度《1小时，温度过高或判定时间过长，可能使凝集的红细胞发生洗脱而沉淀下来，出现假阳性（HI）和假阴性（IHA）试验结果。3）某些血清中可能存在非特异性血凝抑制物或天然血凝素，而出现非特异性结果（HI）因此试验时必须设对照，包括（1）阳性对照V+抗体+血球（2）阴性对照，V+生理盐水+血球（3）血球对照，生理盐水+血球。必要时可用红细胞吸收血清中的非特异性凝集素，或用胰旦白酶除去非特异性抑制物。（主要用于ND的诊断）（二）沉淀反应(precipitation）可溶性抗原与相应抗体结合后，在适量的电解质中，形成肉眼可见的沉淀物（由于该反应的抗原常比抗体分子小，因而在单位体中所含分子数目抗体多，故实验时为了避免抗原过多，常稀释抗原，实验结果也多以抗原的稀释度大小作为沉淀反应的效价）沉淀原参与沉淀反应的抗原沉淀素—AB1：液体内沉淀试验：液相沉淀反应（1）环状沉淀反应小试管中进行：AB试管一AG—两界出现白色沉淀环—阳性

可溶性 Ag+乳胶——颗粒性 Ag+Ab 2） 反向间接凝集反应 可溶性 Ab+载体——颗粒性 Ab+Ag 测某些小分子可溶性 Ag，人主要测乙肝 Ag 3） 协同凝集反应 抗体+SPA——诊断用 SPAAB+未知细菌——凝集反应用于未知菌的鉴定 原理：金黄色葡萄球菌细胞壁上的 A 蛋白(SPA)，具有和大多数哺乳动物 IgG 的 Fc 段发生非特异性结合特性，而 IgG 的 Fab 段则与特异性抗原结合，当标记 的 SPA 上的 IgG 与抗原相见时，则 IgG，Fab 段与抗原结合，从而起到协同凝集 作用，它的特点是即保持了 SPA 标记抗体的方法，对应提高了抗体的敏感性。 含 A 蛋白的金黄色葡萄球菌在反应中起到载体和“放大”的作用。 血凝与血凝抑制反应（HA——HI 试验） 原理：微生物可凝集某些动物的红 C 出现 HA 反应，当加入相应抗体时就出现不凝集 （ＨＩ抑制微生物对红Ｃ的凝集）现象(某些微生物能凝集哺 乳动物 和禽类的红细胞而针 对这种微生物的抗体能抑制近种血凝 反应，前 者称血凝反应，后者称血凝抑制反应) 应用：（１）用已知ＡＢ测未知病毒，诊断传染病 ＮＤ （２）用已知病毒测血清中ＡＢ含量，监测动物免疫水平及早期诊断 方法：常用Ｂ——微量法，——固定病毒稀释血清法(另少用固定血清稀释) 步骤：（１）先测定病毒的ＨＡ效价：稀释病毒＋红Ｃ——血凝 （２）（以ＮＤＶ为例）用已知４单位的病毒＋稀释血清＋红Ｃ——有无凝集体(以完全 抑制 V 血凝反应的血清最高稀释度的倒数来表示抗体的 HI 效价，如 1：256，Log8) 注意问题：1)作 HI 试验时(包括间接血凝试验)一定掌握判定时间和温度，一般以室温 20~30 分钟，4 度《1 小时 ，温度过高或判定时间过长，可能使凝集的红细胞发生冼脱而沉 淀下来，出现假阳性（HI）和假阴性（IHA）试验结果。 3） 某些血清中可能存在非特异性血凝抑制物或天然血凝素，而出现非特异性结果 （HI）因此试验时必须设对照，包括（1）阳性对照 V+抗体+血球（2）阴性对照，V+生理 盐水+血球（3）血球对照，生理盐水+血球。 必要时可用红细胞吸收血清中的非特异性凝集素，或用胰旦白酶除去非特异性抑制物。 （主要用于 ND 的诊断） （二） 沉淀反应(precipitation ) 可溶性抗原与相应抗体结合后，在适量的电解质中，形成肉眼可见的沉淀 物（由于该反应的抗原常比抗体分子小，因而在单位体中所含分子数目抗体多， 故实验时为了避免抗原过多，常稀释抗原，实验结果也多以抗原的稀释度大小作 为沉淀反应的效价） 沉淀原——参与沉淀反应的抗原 沉淀素——ＡＢ １． 液体内沉淀试验：液相沉淀反应 （1）环状沉淀反应 小试管中进行：ＡＢ——试管——ＡＧ——两界出现白色沉淀环——阳性

用途1）兽医上主要用于炭疽Ag的测定。将这种用于测定炭疽抗原的环状沉淀反应叫Ascolis反应2）法医上血迹的鉴定3）昆虫学：天敌的调查（2）絮状沉淀反应：抗原与抗体在试管或玻片上混合，如出现絮状沉淀即为阳性反应，常用于人医诊断梅素的康氏试验。2。凝胶内沉淀反应：固相沉淀反应（1）琼脂扩散试验将Ag，Ab分别加于到1%以下琼脂的半固体中，当Ag，Ab相遇且比例适当时就会形成一条白色沉淀线。1）单向单扩散主要用Ag或Ab的成分和定量分析。（1）测Ag时，抗体十琼脂——制板——分别打孔加入稀释后的抗原-根据沉淀环的大小测Ag的含量（2）测Ab时反之（将抗体混合琼脂中制成平板，打孔，然后将抗原加入孔中，环的直径与抗原浓度成正比）2）单向双扩散，少用。3）双向单扩散，马立克病的诊断。Ab浇板，打孔，孔中加Ag，测定Ag浓度。4）双向双扩散（琼扩，AGP）分别将Ag，AB加入琼脂板的小孔内，双向扩散，两相相遇时出现沉淀线，依沉淀线的有无和出现的距离判断Ag（Ab）的含量（沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性，且与浓度，分子大小及扩散速度相关。当抗原抗体浓度相等，分子大小相近，则沉淀线位于两孔之中呈直线状，当抗原浓度比抗体高时，沉淀线靠近抗体一端并增厚反之亦然。兽医上应用最广的血清学试验，古老但准确性高，操作简便缺点：灵敏度低，检出率低应用：定性测定未知Ag或Ab。分析鉴定Ag成分。检查纯度。定量测定Ab效价。常用于检测：MD，牛白血病（HCB），牛粘膜病，牛传染性鼻气管炎口蹄疫，鸡白血病，IBD5）免疫电泳（IEP）：分析成分及纯度。将琼脂电泳和双向琼脂扩散结合于分析Ag的组分以及AgAb的纯度测定。方法：将等检样品加入琼脂板中小孔中进行电泳一（在琼脂板的一定地方挖一沟槽加入已知Ab一室温扩散一根据沉淀线的多少测纯度（根据沉淀弧的数量

用途１）兽医上主要用于炭疽 Ag 的测定。将这种用于测定炭疽抗原的环状 沉淀反应叫 Ascolis 反应 ２）法医上血迹的鉴定 ３）昆虫学：天敌的调查 （2）絮状沉淀反应：抗原与抗体在试管或玻片上混合，如出现絮状沉淀即 为阳性反应，常用于人医诊断梅素的康氏试验。 ２． 凝胶内沉淀反应：固相沉淀反应 （1）琼脂扩散试验 将Ａg，Ａb 分别加于到 1%以下琼脂的半固体中，当Ａg，Ａb 相遇且比例适 当时就会形成一条白色沉淀线。 １） 单向单扩散 主要用Ａg 或Ａb 的成分和定量分析。 （１）测Ａg 时，抗体＋琼脂——制板——分别打孔加入稀释后的抗原—— 根据沉淀环的大小测Ａg 的含量（２）测Ａb 时反之(将抗体混合琼脂中制成平板， 打孔，然后将抗原加入孔中，环的直径与抗原浓度成正比) ２） 单向双扩散，少用。 ３） 双向单扩散，马立克病的诊断。Ab 浇板，打孔，孔中加 Ag，测定 Ag 浓度。 ４） 双向双扩散（琼扩，AGP） 分别将Ａg，ＡＢ加入琼脂板的小孔内，双向扩散，两相相遇时出现沉淀线， 依沉淀线的有无和出现的距离判断Ａg（Ａb）的含量(沉淀线的特征与位置不仅 取决于抗原抗体的特异性，且与浓度，分子大小及扩散速度相关。当抗原抗体浓 度相等，分子大小相近，则沉淀线位于两孔之中呈直线状，当抗原浓度比抗体高 时，沉淀线靠近抗体一端并增厚反之亦然。 兽医上应用最广的血清学试验，古老但准确性高，操作简便 缺点：灵敏度低，检出率低 应用：定性测定未知 Ag 或 Ab。分析鉴定 Ag 成分。检查纯度。定量测定 Ab 效价。 常用于检测：ＭＤ，牛白血病（ＨＣＢ），牛粘膜病，牛传染性鼻气管炎， 口蹄疫，鸡白血病，ＩＢＤ 5）免疫电泳（IEP）：分析成分及纯度。将琼脂电泳和双向琼脂扩散结合于 分析 Ag 的组分以及 AgAb 的纯度测定。 方法：将等检样品加入琼脂板中小孔中进行电泳—（在琼脂板的一定地方挖 一沟槽加入已知 Ab—室温扩散—根据沉淀线的多少测纯度(根据沉淀弧的数量

多则不纯，少则纯)）位置和外形，对样品中所含成分及其性质作出分析。本法具有高度分辨力，特异性高，样品用量少等特点主要用于血清旦白组成的分析，测定抗原或抗体提纯物的纯度。6）对流免疫电泳法免疫电渗反应）图在双向扩散基础上做的电泳试验Ab1）原理：在通电的琼脂中AgAb间相应电极移动在最适比例处出现沉淀线，Ag负极端，Ab正极端（通电后用抗原在PH8。6缓冲液中带负电荷，帮由阴极向阳极移动；抗体为球旦白，分子较大，移动较慢，因受琼脂电渗影响而向阴极移动，这样就限制了抗原抗体多方向扩散的倾向，使两者向一定方向移动，因而提高了试验的敏感度，特点是短时间内（30~90分钟）形成沉淀线但常缺乏分辨力，若有一很少抗原抗体时可形成沉淀线重叠。2）优点：由于通电和电渗作用限制了AgAb的扩散方向，缩短了扩散时间，灵敏度高，时间短缺点：分辨率不高，Ag，Ab结合部可能出现两条，3条甚至重叠线3）应用：主要用于血清中Ag，Ab的测定，常用检猪的喘气病5）火箭电泳在单向扩散基础上的电泳，主要用于标本中Ag量的测定（相同Ag不同稀释倍数或不同Ag相同~）（方法：将含有定量已知抗体的琼脂制成平板，凝固后在琼脂板的阴板端打一排小孔，各孔中加入不同稀释度的标准抗原极检测抗原，电泳时，抗原在扩散过程中与抗体形成锥形淀峰，其开关形状如火箭，又称火箭电泳。沉淀峰的高低与抗原浓度成正比。本法主要用于测定抗体或其它抗原性旦白质，在兽医诊断上较少应用

多则不纯，少则纯) ) 位置和外形，对样品中所含成分及其性质作出分析。 本法具有高度分辨力，特异性高，样品用量少等特点 主要用于血清旦白组成的分析，测定抗原或抗体提纯物的纯度。 6）对流免疫电泳法免疫电渗反应）图 在双向扩散基础上做的电泳试验 Ａb １） 原理：在通电的琼脂中Ａg Ａb 间相应电极移动在最适比例处出现 沉淀线，Ａg 负极端，Ａb 正极端(通电后用抗原在 PH8。6 缓冲液中带负电荷， 帮由阴极向阳极移动；抗体为球旦白，分子较大，移动较慢，因受琼脂电渗影响 而向阴极移动，这样就限制了抗原抗体多方向扩散 的倾向，使两者向一定方向 移动，因而提高了试验的敏感度，特点是短时间内（30~90 分钟）形成沉淀线， 但常缺乏分辨力，若有一很少抗原抗体时可形成沉淀线重叠。 ２） 优点：由于通电和电渗作用限制了Ａg Ａb 的扩散方向，缩短了 扩散时间，灵敏度高，时间短 缺点：分辨率不高，Ａg，Ａb 结合部可能出现两条，３条甚至重叠线 ３） 应用：主要用于血清中Ａg，Ａb 的测定，常用检猪的喘气病 ５） 火箭电泳 在单向扩散基础上的电泳，主要用于标本中Ａg 量的测定 (相同 Ag 不同稀释倍数或不同 Ag 相同~)（方法：将含有定量已知抗体的琼 脂制成平板，凝固后在琼脂板的阴板端打一排小孔，各孔中加入不同稀释度的标 准抗原极检测抗原，电泳时，抗原在扩散过程中与抗体形成锥形沉淀峰，其开关 形状如火箭，又称火箭电泳。沉淀峰的高低与抗原浓度成正比。本法主要用于测 定抗体或其它抗原性旦白质，在兽医诊断上较少应用

三、补体参与的反应（重点）1．溶解反应（细胞状态的抗原与相应抗体结合后，在补体存在的条件下，则细胞被溶解，如抗原为红细胞，则称溶血反应，其抗体习惯上称溶血素：如抗原为菌细胞，则称为溶菌反应。溶血反应常作为补体结合反应的指示系统。）红细胞+红C抗体（溶血素)+补体一溶血反应常用于补体结合反应的指示系统2．补体结合反应反应系统(被测系统)AgAb1)参与的成分：两个系统充指示系统(红C，溶血素）两对Ag-Ab竞争补体。五个成分Ag，Ab，红C，溶血素，补体(C)（相应的抗原与抗体结合后可结合补体，当加入指示系统后则因无补体而不发生溶血。利用能否发生溶血可判定抗原与抗体是否相应结合。方法：将被检系统的抗原，抗体和补体加入试管中作用一定时间，然后再加入指示系统，继续作用一定时间后，观察结果，如不发生溶血，即为补体结合阳性，表示被检系统中的抗原和抗体发生特异性结合后固定补体，所以加入指示系统后，由于缺之游离补体，而不发生溶血。反之，若出现溶血，为阴性反应，本试验已知的成分（抗原，补体，溶血素，用量要求严格，事前须经过滴度（红试验）否则可引起假反应，故每次操作较繁索，但敏感度的特异性都较高，在兽医上应用很广，用于多种传染病的诊断，如）2）原理：相应的Ag-Ab复合物可结合C当加入指示系统后由于缺乏C而不溶血，利用能否溶血来判定Ag与Ab是否相应AbAg——C—（红C，溶血素）不溶血（+)Ab，Ag—C（红C，溶血素）溶血（-)优点：特异性高，灵敏度高，准确度高，国际兽医局唯一指定方法。缺点：操作繁锁应用：布病，口蹄疫，羊衣原体，牛肺疫的检疫四、免疫标记检测技术（重点）是指用荧光素、酶、放射性同位素、SPA、生物素-亲和素，胶体金等作为示踪物，对抗原或抗体标记后进行的抗原抗体反应，并借助于荧光显微镜、射线测定仪、酶标检测仪等精密一起对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定，实现定性，定位，定量。灵敏度、特异性、准确性远远高于一般血清学方法。（一）免疫荧光抗体技术（IFT1.原理，是一种Ag，Ab结合反应与形态结合的方法，将Ab标记荧光色素，制

三、补体参与的反应（重点） １． 溶解反应 (细胞状态的抗原与相应抗体结合后，在补体存在的条件下，则细胞被溶解， 如抗原为红细胞，则称溶血反应，其抗体习惯上称溶血素：如抗原为菌细胞，则 称为溶菌反应。溶血反应常作为补体结合反应的指示系统。) 红细胞+红 C 抗体(溶血素)+补体—溶血反应 常用于补体结合反应的指示系统 ２． 补体结合反应 反应系统(被测系统)AgAb 1)参与的成分： 两个系统 指示系统(红 C，溶血素) 两对 Ag-Ab 竞争补体。 五个成分 Ag，Ab，红 C，溶血素，补体(C) (相应的抗原与抗体结合后可结合补体，当加入指示系统后则因无补体而不 发生溶血。利用能否发生溶血可判定抗原与抗体是否相应结合。方法：将被检系 统的抗原，抗体和补体加入试管中作用一定时间，然后再加入指示系统，继续作 用一定时间后，观察结果，如不发生溶血，即为补体结合阳性，表示被检糸统中 的抗原和抗体发生特异性结合后固定了补体，所以加入指示系统后，由于缺乏游 离补体，而不发生溶血。反之，若出现溶血，为阴性反应，本试验已知的成分（抗 原，补体，溶血素，用量要求严格，事前须经过滴度（红 试验）否则可引起假 反应，故每次操作较繁索，但敏感度的特异性都较高，在兽医上应用很广，用于 多种传染病的诊断，如） 2）原理：相应的 Ag-Ab 复合物可结合 C 当加入指示系统后由于缺乏 C 而 不溶血，利用能否溶血来判定 Ag 与 Ab 是否相应 Ab Ag ——C——（红 C，溶血素）不溶血（+） Ab，Ag——C——（红 C，溶血素）溶血（-） 优点：特异性高，灵敏度高，准确度高，国际兽医局唯一指定方法。 缺点： 操作繁锁 应用：布病，口蹄疫，羊衣原体，牛肺疫的检疫 四、 免疫标记检测技术（重点） 是指用荧光素、酶、放射性同位素、SPA、生物素-亲和素，胶体金等作为 示踪物，对抗原或抗体标记后进行的抗原抗体反应，并借助于荧光显微镜、射线 测定仪、酶标检测仪等精密一起对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定，实 现定性，定位，定量。灵敏度、特异性、准确性远远高于一般血清学方法。 （一）免疫荧光抗体技术（IFT） 1.原理，是一种 Ag，Ab 结合反应与形态结合的方法，将 Ab 标记荧光色素，制

成荧光抗体再与本应Ag发生特异性结合，在荧光显微镜下观察组织细胞内Ag——Ab结合物，以此对标本中相应的Ag进行定性和定位。原理：荧光色素（不发光）+Ab—荧光Ab染色+病料组织Ag（荧光色素是一种染料，本身不发光，但在紫外线，蓝绿色或绿光照射下，吸收光量子而激化，并释放出可见光，称为荧光，这种荧光色素在一定条件下可与抗体结合形成荧光标记的荧光抗体，当这种荧光抗体与相应抗原结合时由于紫外光照射而使荧光素激发产生可见光的黄绿色荧光，则在结合物上出现黄绿色或玫瑰红色荧光，根据荧光的出现就可标明被检抗原是否与抗体相一致，从而诊断疾病。）常用的荧光色素：异硫氢酸荧光素（FITC）2.常用荧光抗体染色法A一直接荧光抗体染色法（标记抗体）1）主要用于测定组织C中Ag以及Ag的定位2）用已知标记的荧光Ab直接测病料组织中Ag3）方法：病料涂片（冰冻切片）（4度，冷丙酮固定）10~15分钟水洗——荧光Ab染色——37度30~60分钟——水洗——封片加甘油荧光显微镜下一兰绿色荧光4）优点：操作简便，非特异性荧光少，准确性高缺点：灵敏度差，且一种动物只能测一种Ag5）应用：快速诊断传染病（猪瘟，猪传染性胃肠炎，猪伪狂犬病，鸡ND，狂犬病）B.间接法：既可测Ag以或测Ab（IFA）是将待检材料(未知抗原)先与未标记的特异性抗体结合，然后再滴加荧光标记的抗免疫球旦白抗体（抗抗体或第二抗体)阳性时，形成抗原-抗体-荧光抗体复合物。此法有两对抗原抗体系统，第一对是待测抗原与相应未标记的抗体，第二对是抗体与相应荧光色素标记的抗球日白抗体（抗抗体）由于夹层球且白分上有多个抗原决定簇，因而能结合多个荧光抗体分子，所以间接法比直接法敏感。优点是一种标记好的抗球且白抗体，可用于多种抗原抗体系统。1）优点：用一种已标记好的抗球蛋后测多种Ag（Ab）2）方法：测Ag病料制片一固定一特异性Ab（未标记第一抗体）——水洗——标记荧光的抗球蛋白Ab（第二Ab）——水洗—封片——镜检用于传染病的快速诊断，特异性好，灵敏度高

成荧光抗体再与本应 Ag 发生特异性结合，在荧光显微镜下观察组织细胞内 Ag——Ab 结合物，以此对标本中相应的 Ag 进行定性和定位。 原理：荧光色素（不发光）+Ab——荧光 Ab 染色+病料组织 Ag （荧光色素是一种染料，本身不发光，但在紫外线，蓝绿色或绿光照射下， 吸收光量子而激化，并释放出可见光，称为荧光，这种荧光色素在一定条件下可 与抗体结合形成荧光标记的荧光抗体，当这种荧光抗体与相应抗原结合时由于紫 外光照射而使荧光素激发产生可见光的黄绿色荧光，则在结合物上出现黄绿色或 玫瑰红色荧光，根据荧光的出现就可标明被检抗原是否与抗体相一致，从而诊断 疾病。） 常用的荧光色素：异硫氢酸荧光素（FITC） 2.常用荧光抗体染色法 A—直接荧光抗体染色法（标记抗体） １） 主要用于测定组织 C 中 Ag 以及 Ag 的定位 ２） 用已知标记的荧光 Ab 直接测病料组织中 Ag ３） 方法：病料涂片（冰冻切片）（4 度，冷丙酮固定）10~15 分钟—— 水洗——荧光 Ab 染色——37度 30~60 分钟——水洗——封片加甘油荧光显微镜 下——兰绿色荧光 ４） 优点：操作简便，非特异性荧光少，准确性高 缺点：灵敏度差，且一种动物只能测一种 Ag ５） 应用：快速诊断传染病（猪瘟，猪传染性胃肠炎，猪伪狂犬病，鸡 ND，狂犬病） B．间接法：既可测 Ag 以或测 Ab（IFA） 是将待检材料(未知抗原)先与未标记的特异性抗体结合，然后再滴加荧光标 记的抗免疫球旦白抗体(抗抗体或第二抗体)阳性时，形成抗原-抗体-荧光抗体复 合物。此法有两对抗原抗体系统，第一对是待测抗原与相应未标记的抗体，第二 对是抗体与相应荧光色素标记的抗球旦白抗体(抗抗体)由于夹层球旦白分上有 多个抗原决定簇，因而能结合多个荧光抗体分子，所以间接法比直接法敏感。优 点是一种标记好的抗球旦白抗体，可用于多种抗原抗体系统。 １） 优点：用一种已标记好的抗球蛋后测多种 Ag（Ab） ２） 方法：测 Ag 病料制片——固定——特异性 Ab（未标记第一抗体） ——水洗——标记荧光的抗球蛋白 Ab（第二 Ab）——水洗-——封片——镜检 用于传染病的快速诊断，特异性好，灵敏度高

（二）免疫酶技术（IET）1.原理：将抗原抗体反应的特异性与酶的高效催化作用相结合。利用酶与Ab（Ag）结合后既不改变Ab，Ag的特异性反应也不影响E本身的活性，将E标记在Ab上，就形成了E标Ab再与相应Ag结合，和底物反应发生酶水解显色反应。酶—Ab—酶标AbAg十底物显色标记E的要求1）纯度高特异性高较稳定2）方法简单显色快敏感3）与Ab交联后仍保持酶的活性最常用的E：辣根过氧化物酶（HRP）此E底物：1）邻苯二胺（OPD）可溶性2）二甲基联苯胺盐酸盐（DAB）不溶性用于固相标记2.染色方法（1）酶联免疫吸附试验（ELISA）：将Ag或Ab吸附于固相载体上，在载体上进行的免疫酶染色，底物显色后用肉眼或标测定仪判定结果的一种方法。优点：特异性高，灵敏度高，检测方便（易推广），大通量，快速特点，因此最常用。每加一层需要37°作用30min。洗涤PBS反复3遍。1）直接法：主要用以测定未知抗原以及抗血清的效价待检Ag包板封闭液（特牛血清PBS）封孔特异性E标Ab一洗涤（PBS）—底物（OPD）显色中止反应（2NH2SO4或H2O2）—测定一眼观或酶标仪自动测定OD值2）间接法：主要用于测定未知的Ab以及免疫效果的测定，传染病的快速诊断（猪瘟，鸡ND，鸡传染性支气管炎）已知Ag包板十封闭液封闭一待检抗体（洗涤）一酶标第二抗体（洗涤）——底物——中止反应显色观察3)双抗夹心法，测定大分子抗原。主要测定血液及分泌液中小分子的循环抗原以及病料中的某些大分子抗原（先用抗体致敏载体表面，然后将待测抗原溶液加入并温育，最后加入酶标记抗体，通过特殊底物显示复合物的存在，这种方法是两抗体之间夹着抗原，犹如夹心饼干，又称夹法。）原理：两个Ab中夹一个未知Ag，此法用于快速诊断鸡ND猪瘟4）竞争ELＩSA法

（二）免疫酶技术（IET） 1.原理：将抗原抗体反应的特异性与酶的高效催化作用相结合。 利用酶与 Ab（Ag）结合后既不改变 Ab，Ａg 的特异性反应也不影响Ｅ本身 的活性，将Ｅ标记在Ａb 上，就形成了Ｅ标Ａb 再与相应Ａg 结合，和底物反应 发生酶水解显色反应。 酶—Ａb—酶标Ａb—Ａg＋底物——显色 标记Ｅ的要求 １）纯度高特异性高较稳定 ２）方法简单显色快敏感 ３） 与Ａb 交联后仍保持酶的活性 最常用的Ｅ：辣根过氧化物酶（ＨＲＰ） 此Ｅ底物：１）邻苯二胺（ＯＰＤ）可溶性 ２）二甲基联苯胺盐酸盐（ＤＡＢ）不溶性用于固相标记 2．染色方法 （１） 酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）：将 Ag 或 Ab 吸附于固相载体上， 在载体上进行的免疫酶染色，底物显色后用肉眼或酶标测定仪判定结果的一种方 法。 优点：特异性高，灵敏度高，检测方便（易推广），大通量，快速特点，因此最 常用。每加一层需要 37°作用 30min。洗涤 PBS 反复 3 遍。 １）直接法：主要用以测定未知抗原以及抗血清的效价 待检Ａg 包板封闭液（犊牛血清ＰＢＳ）封孔——特异性Ｅ标Ａb—洗涤（Ｐ ＢＳ）——底物（ＯＰＤ）——显色——中止反应（２ＮＨ2ＳＯ4 或Ｈ2Ｏ2）— 测定－眼观或酶标仪自动测定ＯＤ值 ２）间接法：主要用于测定未知的Ａb 以及免疫效果的测定，传染病的快速 诊断（猪瘟，鸡ＮＤ，鸡传染性支气管炎） 已知Ａg 包板＋封闭液封闭——待检抗体（洗涤）——酶标第二抗体（洗涤） ——底物——中止反应显色观察 3)双抗夹心法，测定大分子抗原。 主要测定血液及分泌液中小分子的循环抗原以及病料中的某些大分子抗原 (先用抗体致敏载体表面，然后将待测抗原溶液加入并温育，最后加入酶标 记抗体，通过特殊底物显示复合物的存在，这种方法是两抗体之间夹着抗原，犹 如夹心饼干，又称夹法。) 原理：两个Ａb 中夹一个未知Ａg，此法用于快速诊断鸡ＮＤ猪瘟 ４） 竞争ＥＬＩＳＡ法

标记Ag竞争法：主要用于测定循环血液中小分子的抗原如激素根据其标记Ag（Ab）的不同分为：标记Ag竞争法，标记Ab竞争法抗体包被酶标板（加酶标抗原（对照）加酶标抗原+待检抗原混合液（试验）根据两类对酶底物竞争水解的差值来确定待检溶液中的无特异抗原或抗原量的多少)，在未知抗原孔中，抗原越多，则酶标记抗原结合量愈少，OD值愈低，显色淡，可通过分光光度计测出准确值。并与对照孔比较。已知Ab包板（两孔）（标记Ag+生理盐水）（待测Ag十标记Ag）+底物一显色标记Ab竞争法：反之5）斑点法（DOTELISA）将硝酸（醋酸）纤维膜切成小片作载体，后包被已知Ag再用间接法测定（试验时将待检血清溶上包被膜上，然后滴上酶标抗体（第二抗体），在底物溶液中显色，直接根据颜色变化读取结果，结果可保存也可扫描分析。未知的Ab与间接法不同的是A。载体醋酸纤维膜B。底物DAB（不溶性）2.免疫酶组化染色法（1）直接法（2）间接法主要用于Ag定位。病变组织的寻找。主要用于测定病料组织中的毒Ag和细菌Ag以Ag一Ab的酶标反应与组织化学相结合，经镜检，类似于脂酶染色法（ANAE）直接法（应用最多）间接法与ELISA法不同点A。待测抗原固定于玻片上且要消除细胞内的源酶B。底物必须是不溶性的（常用DAB）以NDV测定来介绍直接法1）病料涂片（脑）一1%H202（消除）一甲醛固定10分钟一（PBS洗）抗ND的酶标Ab染色30分钟一（洗）底物DAB一中止（自来水冲洗）一一镜检一一细胞内如出现黄棕色颗粒为“十”。不足之处：非特异性现象较多。（三）放射免疫测定目前，标记技术中最敏感的方法，同位素的分析与Ag一一Ab反应结合，兽医上主要用于某些H，微量生物活性物质的测定常用：竞争放免法原理：用于放射性同位素I131与特异性Ag相结合形成碘标记的Ag，加入已知Ab中再加入待测未标记的Ag二者竞争Ab测I的放射强度。的含量可知

标记Ａg 竞争法：主要用于测定循环血液中小分子的抗原如激素 根据其标记Ａg（Ａb）的不同分为：标记Ａg 竞争法，标记Ａb 竞争法 抗体包被酶标板(加酶标抗原(对照) 加酶标抗原+待检抗原混合液(试验) 根据两类对酶底物竞争水解的差值来确定待检溶液中的无特异抗原或抗原 量的多少)，在未知抗原孔中，抗原越多，则酶标记抗原结合量愈少，OD 值愈低， 显色淡，可通过分光光度计测出准确值。并与对照孔比较。 已知Ａb 包板（两孔）（标记Ａg＋生理盐水）（待测Ａg＋标记Ａg）＋底物 ——显色 标记 Ab 竞争法：反之 ５）斑点法（ＤＯＴ——ＥＬＩＳＡ） 将硝酸（醋酸）纤维膜切成小片作载体，后包被已知Ａg 再用间接法测定 (试验时将待检血清溶上包被膜上，然后滴上酶标抗体(第二抗体)，在底物溶 液中显色，直接根据颜色变化读取结果，结果可保存也可扫描分析。 未知的Ａb 与间接法不同的是 Ａ。载体——醋酸纤维膜 Ｂ。底物——ＤＡＢ（不溶性） 2.免疫酶组化染色法 （1）直接法 （2）间接法主要用于 Ag 定位。病变组织的寻找。 主要用于测定病料组织中的毒Ａg 和细菌Ａg 以Ａg—Ａb 的酶标反应与组织化学相结合，经镜检，类似于脂酶染色法（Ａ ＮＡＥ）直接法（应用最多）间接法 与ＥＬＩＳＡ法不同点Ａ。待测抗原固定于玻片上且要消除细胞内的源酶 Ｂ。底物必须是不溶性的（常用ＤＡＢ） 以ＮＤＶ测定来介绍直接法 １） 病料涂片（脑）—１％Ｈ2Ｏ2（消除）—甲醛固定１０分钟——（Ｐ ＢＳ洗）抗ＮＤ的酶标Ａb 染色３０分钟——（洗）底物ＤＡＢ——中止（自来 水冲洗）——镜检 ——细胞内如出现黄棕色颗粒为“＋”。不足之处：非特异性 现象较多。 （三）放射免疫测定 目前，标记技术中最敏感的方法，同位素的分析与Ａg——Ａb 反应结合， 兽医上主要用于某些Ｈ，微量生物活性物质的测定 常用：竞争放免法 原理：用于放射性同位素Ｉ131 与特异性Ａg 相结合形成碘标记的Ａg，加入 已知Ａb 中再加入待测未标记的Ａg 二者竞争Ａb 测Ｉ的放射强度。的含量可知