《动物微生物与免疫学》课程实验指导（兽医微生物学课程实习指导）

兽医微生物学课程实习指导为了使学生全面掌握微生物学的基木技术，使课堂讲授和实验密切结合，把理论和实践有机地统一，结合生产实际系统地进行一周课程实习，加强学生的实际操作能力和微生物学检验的本领。一、目的与要求()目的1.使学生全面系统地掌握兽医微生物学的基本技术和细菌检验的基本程序，掌握各种生理生化试验的原理和试验方法。2.加强学生对临床常见病原菌鉴定本领的操作训练。3．使学生熟练掌握微生物实验室常用仪器的使用和培养基制备的原则和方法。().要求1．加强课程实习教学的组织工作，教师要认真负责，严格要求，耐心指导。要引导学生用综合分析法对试验结果进行分析，以便得出正确的鉴定结论。2.要求学生要认真抓住课程实习的实践机会，熟悉微生物实验的基本技术，每一步实验要认真对待，对实验结果要仔细分析，认真记录，实习结束前要认真总结并写出实验报告。3.要求学生在进行兽医微生物课程实习前，重温本实验室的各项规章制度、要求及各实验仪器设备的使用说明书（参见附录三）。严格按照《微生物实验室注意事项》、《避免传染的须知》、《高压蒸汽消毒器》等中的各条款执行。白：必备参考资料1.《兽医微生物学》陆承平主编中国农业出版社2.《兽医微生物学实验指导》姚火春主编中国农业出版社3.《兽医微生物课程实习指导》微生物课程组编二、课程实习内容与步骤(). 内容1.对提供的1、2"检验材料进行细菌学检验，这包括涂片染色镜检、细菌的分离培养、生理生化试验、实验动物致病性试验、药物敏感性试验等致病菌的系统鉴定与诊断。这些菌包括：

兽医微生物学课程实习指导 为了使学生全面掌握微生物学的基木技术，使课堂讲授和实验密切结合，把理论和实践 有机地统一，结合生产实际系统地进行一周课程实习，加强学生的实际操作能力和微生物学 检验的本领。 一、目的与要求 ㈠．目的 1．使学生全面系统地掌握兽医微生物学的基本技术和细菌检验的基本程序，掌握各种生理生 化试验的原理和试验方法。 2．加强学生对临床常见病原菌鉴定本领的操作训练。 3．使学生熟练掌握微生物实验室常用仪器的使用和培养基制备的原则和方法。 ㈡．要求 1．加强课程实习教学的组织工作，教师要认真负责，严格要求，耐心指导。要引导学生用综 合分析法对试验结果进行分析，以便得出正确的鉴定结论。 2．要求学生要认真抓住课程实习的实践机会，熟悉微生物实验的基本技术，每一步实验要认 真对待，对实验结果要仔细分析，认真记录，实习结束前要认真总结并写出实验报告。 3. 要求学生在进行兽医微生物课程实习前，重温本实验室的各项规章制度、要求及各实验仪 器设备的使用说明书（参见附录三）。严格按照《微生物实验室注意事项》、《 避免传染的须 知》、《高压蒸汽消毒器》等中的各条款执行。 ㈢．必备参考资料 1.《兽医微生物学》陆承平主编 中国农业出版社 2.《兽医微生物学实验指导》 姚火春主编 中国农业出版社 3.《兽医微生物课程实习指导》 微生物课程组编 二、课程实习内容与步骤 ㈠．内容 1．对提供的 1 #、2 #检验材料进行细菌学检验，这包括涂片染色镜检、细菌的分离培养、生理 生化试验、实验动物致病性试验、药物敏感性试验等致病菌的系统鉴定与诊断。 这些菌包括：

①.引起禽霍乱、牛出败、猪肺疫的多杀性巴氏杆菌（P.multocida）（代表生长要求较高一级的菌群）；②.引起人和动物肠炎的沙门氏菌属细菌，如鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）代表肠杆菌科致病性沙门氏菌）；③.引起仔猪大肠杆菌病（仔猪黄痢、白痢、水肿病）的致病性大肠杆菌（E.coli)；④.兽医上重要的球菌（葡萄球菌、链球菌）2.从提供的3检验材料中进行涂片镜检、分离培养、动物感染、毒素检测等。兽医上重要的梭菌病，如致羔羊疾、羊肠毒血症，出血性肠炎的产气荚膜梭菌（CL.perfringenes）（代表厌养菌群）；.步骤1.分组及接收任务：首先由指导教师给每组1"、2、3三份病料（其中1"、2为未知致病菌菌、3为致病菌产气荚膜梭菌），同时附有1"、2病料发病动物临床症状或死后剖检变化简要说明。2.对被检材料的初步检验：各组在接到病料、被检材料后，进行涂片，革兰氏染色，分辨是革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌？是球状菌还是杆状菌？是大杆菌、中等大小杆菌、还是球杆菌？菌体能否看到芽胞、荚膜，或菌体呈两极着色或有异染颗粒？同时采集3”病料肠内容物备用。3.拟定具体实施方案：根据所观察到的主要菌体的染色特征和形态学特征并结合所给病料情况，每组可以初步把自己的思考范围缩小到某一个或二个菌属内，然后以小组为单位，拟定具体实施方案，其内容有：①.可疑这个菌属具有什么生物学特性（需氧菌还是厌氧菌，或兼性厌氧菌，最适生长条件、温度，pH等）；②.分离培养这类群细菌需要制作哪些培养基？从实际出发，应用于一个细菌分离与鉴别培养试验数目保持在一个最低限度，列出培养基清单（参考附录一、二），交负责教师审查；③.从实际出发，鉴定这类菌最低限度需要制作哪几种生理、生化试验培养基和有鉴别意义的糖培养基（可参考各类细菌检索的主要生理、生化项目），列出培养基清单（参考附录一、二），交负责教师审查：④.动物致病性试验时，最敏感的动物是什么？注射量和注射途径？列出动物实验计划及所

①．引起禽霍乱、牛出败、猪肺疫的多杀性巴氏杆菌（P. mul tocida）（代表生长要求较高 一级的菌群）； ②．引起人和动物肠炎的沙门氏菌属细菌，如鼠伤寒沙门氏菌(S. typhimurium)代表肠杆菌 科致病性沙门氏菌）； ③．引起仔猪大肠杆菌病（仔猪黄痢、白痢、水肿病）的致病性大肠杆菌（E. col i）； ④．兽医上重要的球菌（葡萄球菌、链球菌） 2．从提供的 3 #检验材料中进行涂片镜检、分离培养、动物感染、毒素检测等。 兽医上重要的梭菌病，如致羔羊痢疾、羊肠毒血症，出血性肠炎的产气荚膜梭菌 （CL.perfringenes ）（代表厌养菌群）； ㈡．步骤 1．分组及接收任务： 首先由指导教师给每组 1 #、2 #、3 #三份病料（其中 1 #、2 #为未知致病菌菌、3 #为致病菌产 气荚膜梭菌），同时附有 1 #、2 #病料发病动物临床症状或死后剖检变化简要说明。 2．对被检材料的初步检验： 各组在接到病料、被检材料后，进行涂片，革兰氏染色，分辨是革兰氏阳性菌还是革兰 氏阴性菌？是球状菌还是杆状菌？是大杆菌、中等大小杆菌、还是球杆菌？菌体能否看到芽 胞、荚膜，或菌体呈两极着色或有异染颗粒？同时采集 3 # 病料肠内容物备用。 3．拟定具体实施方案： 根据所观察到的主要菌体的染色特征和形态学特征并结合所给病料情况，每组可以初步 把自己的思考范围缩小到某一个或二个菌属内，然后以小组为单位，拟定具体实施方案，其 内容有： ①．可疑这个菌属具有什么生物学特性（需氧菌还是厌氧菌，或兼性厌氧菌，最适生长条件、 温度,pH 等）； ②．分离培养这类群细菌需要制作哪些培养基？从实际出发，应用于一个细菌分离与鉴别培 养试验数目保持在一个最低限度，列出培养基清单（参考附录一、二），交负责教师审查； ③．从实际出发，鉴定这类菌最低限度需要制作哪几种生理、生化试验培养基和有鉴别意义 的糖培养基（可参考各类细菌检索的主要生理、生化项目），列出培养基清单（参考附录一、 二），交负责教师审查； ④．动物致病性试验时，最敏感的动物是什么？注射量和注射途径？列出动物实验计划及所

需动物、器械清单，交负责教师审查4.制备培养基：根据本组列出并经指导教师审查批准的培养基清单进行培养基制备。包括分离培养用培养基和各项生理生化试验培养基。注意先制备分离与移植用培养基，后制备生化鉴定5.被检材料的病理剖检和细菌的分离培养。将1、2"、3"病料表面灭菌后从深部取材划线接种于适宜地分离用培养基平板上，37℃孵育24-48h，从中选出孤立单个菌落，经染色涂片检查与初次组织抹片染色镜检观察到的菌体形态和染色特性一致的单一菌，再挑取单个菌落接种于固体琼脂斜面或鲜血琼脂斜面2管和液体培养基2管37℃孵育24h，取出即为纯培养物。（注意在对3病料取材进行分离培养的同时进行肠内容物的采集，4℃保存备用。）6.分离菌培养特性观察和生理生化试验(1)：用上述1"、2*病料固体斜面纯培养物接种于各种不同的生理生化试验培养基上，37℃孵育24一48h，甚至可延长72一96h，观察和记录各项试验结果。观察分离培养菌在固体琼脂平板和鲜血琼脂平板上生长表现和溶血性，观察在液体培养基中的生长表现和运动性、排列、以及大小的测定。(2).用1"、2"病料的液体纯培养物，进行药物敏感试验（参照姚火春主编的《兽医微生物学实验指导》实验八和附录三《药敏药片的制备》）(3).用上述3病料的液体纯培养物，进行培养物毒素检测，包括溶血试验、坏死试验、致死试验。（参照姚火春主编的《兽医微生物学实验指导》实验十八）7.动物实验：(1)、用1"、2"病料的液体纯培养物，进行实验动物感染试验。(2).对采集到的3病料肠内容物进行肠内容物毒素检测试验。（参照姚火春主编的《兽医微生物学实验指导》实验十八、姚火春主编的《兽医微生物学实验指导》附录四）8.报告试验结果：根据各项试验结果，分析判断你组从1"、2"病料中分离鉴定的菌是什么菌并由此可确诊所发生疫病名称，写出微生物学诊断报告、提出用药方案，并向全班汇报各组鉴定结果三、日期安排与分组1.由于课程实习时间仅一周（五天），要按时完成实习任务，必须要有具体的安排和分工。2.6人为一组，选组长一人。3.实验室工作人员必须确保被检材料新鲜、充足。备用菌种要纯，不能污染，试验所用平血、试管等提前灭菌好。4.各组所用的培养基和试剂要自己亲自动手配制。第二天所用的培养基和试剂当天下午和实验室工作人

需动物、器械清单，交负责教师审查； 4．制备培养基： 根据本组列出并经指导教师审查批准的培养基清单进行培养基制备。包括分离培养用培 养基和各项生理生化试验培养基。注意先制备分离与移植用培养基，后制备生化鉴定 5．被检材料的病理剖检和细菌的分离培养。 将 1 #、2 #、3 #病料表面灭菌后从深部取材划线接种于适宜地分离用培养基平板上，37℃孵 育 24-48 h，从中选出孤立单个菌落，经染色涂片检查与初次组织抹片染色镜检观察到的菌 体形态和染色特性一致的单一菌，再挑取单个菌落接种于固体琼脂斜面或鲜血琼脂斜面 2 管 和液体培养基 2 管 37℃孵育 24 h,取出即为纯培养物。（注意在对 3 #病料取材进行分离培养的 同时进行肠内容物的采集，4℃保存备用。） 6．分离菌培养特性观察和生理生化试验 ⑴．用上述 1 #、2 #病料固体斜面纯培养物接种于各种不同的生理生化试验培养基上，37℃ 孵育 24—48 h，甚至可延长 72—96 h，观察和记录各项试验结果。观察分离培养菌在固体琼 脂平板和鲜血琼脂平板上生长表现和溶血性，观察在液体培养基中的生长表现和运动性、排 列、以及大小的测定。 ⑵．用 1 #、2 #病料的液体纯培养物，进行药物敏感试验（参照姚火春主编的《兽医微生物 学实验指导》实验八和附录三《药敏药片的制备》） ⑶.用上述 3 #病料的液体纯培养物，进行培养物毒素检测，包括溶血试验、坏死试验、致死 试验。（参照姚火春主编的《兽医微生物学实验指导》实验十八） 7．动物实验： ⑴、用 1 #、2 #病料的液体纯培养物，进行实验动物感染试验。 ⑵.对采集到的 3 #病料肠内容物进行肠内容物毒素检测试验。（参照姚火春主编的《兽医微生 物学实验指导》实验十八、姚火春主编的《兽医微生物学实验指导》附录四） 8．报告试验结果： 根据各项试验结果，分析判断你组从 1 #、2 #病料中分离鉴定的菌是什么菌并由此可确诊 所发生疫病名称，写出微生物学诊断报告、提出用药方案，并向全班汇报各组鉴定结果。 三、日期安排与分组 1． 由于课程实习时间仅一周（五天），要按时完成实习任务，必须要有具体的安排和分工。 2． 6 人为一组，选组长一人。 3．实验室工作人员必须确保被检材料新鲜、充足。备用菌种要纯，不能污染，试验所用平皿、试管等提 前灭菌好。 4．各组所用的培养基和试剂要自己亲自动手配制。第二天所用的培养基和试剂当天下午和实验室工作人

员连系，及时准备5.各组所使用的仪器、设备等，使用完毕后必须保持清洁、完好，放回原处

员连系，及时准备。 5．各组所使用的仪器、设备等 ，使用完毕后必须保持清洁、完好，放回原处

日期安排与分组(一)、日期安排日期节次内容星期一1-2由带实习教师，讲清实习目的；介绍实习教师；分组、产生组长。1.7/62.安排实习内容分发病料简介；3．仔细阅读实习指导内容，熟悉实习内容；4.熟悉常用仪器使用5.以小组为单位拟定实验方案3-4体育5-61.分发1病料标本、剖检，观察病理变化，记录2.分组进行病料涂片，染色镜检3．根据染色镜检结果，讨论鉴定方案，制备分离用培养基星期二1-21.对1病料进行细菌分离培养，接种于种于适宜地分离用培养基上8/637℃培养。2.做题注：进行分离培养时，要求两人一组，互相配合进行 3-4英语1.对2"病料（为产气荚膜梭菌）进行动物剖检，记录病理变化；5-62.对2”病料进行细菌分离培养（接种于种于适宜地分离用培养基上37℃培养）；注：要求两人一组，互相配合进行。3.采集2病料肠内容物，4℃保存备用福4对2病料进行涂片、染色、镜检，记录结果星期三1-21.挑取单个菌落，染色镜检9/62.接种于固体斜面和平板上3.接种于液体培养基4.做题3-4毒理5-61.对采集到的2”病料肠内容物进行肠内容毒素检测（1/22.做题星期四1-2英语10/63-41.观察分离菌在固体琼脂平板和液体培养基中生长表现；5-62.用1病料的纯培养固体斜面培养物进行生化试验接种和动物致病性试验；3.用2"病料的纯培养液体培养物进行培养物毒素检测试验；溶血试验致死试验@4.对用过的器械进行灭菌、清洗处理。星期五1-2毒理11/63-61.进行各项生理生化试验；2.实验动物剖检、取材、染色、镜检（时间根据实验动物情况定）；3.对用过的器械进行灭菌、清洗处理；4.各组分别讨论鉴定结果；5.总结教学实习、分组汇报实习结果与收获

日期安排与分组 ㈠、日期安排 日期 节次 内容 星期一 7/6 1-2 1. 由带实习教师，讲清实习目的；介绍实习教师；分组、产生组长。 2. 安排实习内容分发病料简介； 3. 仔细阅读实习指导内容，熟悉实习内容； 4. 熟悉常用仪器使用 5. 以小组为单位拟定实验方案 3-4 体育 5-6 1．分发 1 #病料标本、剖检，观察病理变化，记录 2．分组进行病料涂片，染色镜检 3．根据染色镜检结果，讨论鉴定方案，制备分离用培养基 星期二 8/6 1-2 1．对 1 #病料进行细菌分离培养，接种于种于适宜地分离用培养基上 37℃培养。 2．做题 注：进行分离培养时，要求两人一组，互相配合进行。 3-4 英语 5-6 1．对 2 # 病料（为产气荚膜梭菌）进行动物剖检，记录病理变化； 2．对 2 # 病料进行细菌分离培养（接种于种于适宜地分离用培养基上 37℃培养）；注：要求两人一组，互相配合进行。 3. 采集 2 # 病料肠内容物，4℃ 保存备用。 4．对 2 # 病料进行涂片、染色、镜检，记录结果。 星期三 9/6 1-2 1.挑取单个菌落，染色镜检 2.接种于固体斜面和平板上 3.接种于液体培养基 4．做题 3-4 毒理 5-6 1. 对采集到的 2 # 病料肠内容物进行肠内容毒素检测(1/2) 2. 做题 星期四 10/6 1-2 英语 3-4 5-6 1．观察分离菌在固体琼脂平板和液体培养基中生长表现； 2. 用 1 # 病料的纯培养固体斜面培养物进行生化试验接种和动物致病性 试验； 3．用 2 # 病料的纯培养液体培养物进行培养物毒素检测试验； 溶血试验④ 致死试验⑥ 4.对用过的器械进行灭菌、清洗处理。 星期五 11/6 1-2 毒理 3-6 1．进行各项生理生化试验； 2．实验动物剖检、取材、染色、镜检（时间根据实验动物情况定）； 3．对用过的器械进行灭菌、清洗处理； 4．各组分别讨论鉴定结果； 5．总结教学实习、分组汇报实习结果与收获

附录一下列致病菌分离鉴定需要进行的最低限度试验项目①.巴氏杆菌属需要制备鲜血琼脂平板、鲜血琼脂斜面、血清肉汤、蔗糖、乳糖、甘露醇培养基、靛基质试验、硝酸盐还原试验、醋酸铅琼脂柱或含醋酸铅纸条等，（注：糖发酵培养基用前需加1滴无菌灭活牛血清）；②．沙门氏菌和大肠杆菌的鉴定用普通肉汤、普通琼脂平板、普通琼脂斜面、三糖铁琼脂斜面、麦康凯培养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、杨苷发酵试验培养基，靛基质试验，M.R试验，V.P试验用培养基，柠檬酸盐利用和硝酸盐还原试验用培养基等，必要时尚需要进行细菌血清型鉴定；③.产气荚膜梭菌（梭菌等）鉴定需制备葡萄糖鲜血琼脂平板、葡萄糖血清琼脂平板、厌氧肉肝汤、牛乳培养基、卵磷脂酶试验用培养基，硝酸盐还原试验培养基，麦芽糖、乳糖、杨苷、葡萄糖等发酵试验培养基，必要时要做毒素的中和试验，以确定致病菌型(A, B, C, D, E, ) ;

附录一 下列致病菌分离鉴定需要进行的最低限度试验项目 ①．巴氏杆菌属 需要制备鲜血琼脂平板、鲜血琼脂斜面、血清肉汤、蔗糖、乳糖、甘露醇 培养基、靛基质试验、硝酸盐还原试验、醋酸铅琼脂柱或含醋酸铅纸条等，（注： 糖发酵培养基用前需加 1 滴无菌灭活牛血清）； ②．沙门氏菌和大肠杆菌的鉴定 用普通肉汤、普通琼脂平板、普通琼脂斜面、三糖铁琼脂斜面、麦康凯培 养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、杨苷发酵试验培养基，靛基质试验,M. R 试验，V. P 试验用培养基，柠檬酸盐利用和硝酸盐还原试验用培养基等，必要时尚需要进 行细菌血清型鉴定； ③．产气荚膜梭菌（梭菌等） 鉴定需制备葡萄糖鲜血琼脂平板、葡萄糖血清琼脂平板、厌氧肉肝汤、牛乳 培养基、卵磷脂酶试验用培养基，硝酸盐还原试验培养基，麦芽糖、乳搪、杨 苷、葡萄糖等发酵试验培养基，必要时要做毒素的中和试验，以确定致病菌型 (A,B,C,D,E,)；

附录二培养基与培养基的制备（一）牛肉水（牛肉浸出液）成分：瘦牛肉50g常水100ml制法：（1）除去瘦牛肉的脂肪、腱膜、切成小块，用绞肉机绞碎。（2）称其重量，加倍量水，浸泡一夜（夏天防止腐败应置冷处）。（3）煮沸1h，在加热煮沸中间，应多次搅拌。（4）用纱布滤去肉渣挤出肉水，再用滤纸过滤。（5）补足原水量、分装于瓶中，121C高压蒸汽灭菌20min，置冷暗处保存。注：现多用牛肉营制备肉水，其浓度为0.3%-0.5%。用途：制作各种培养基的基础。注：①牛肉加水后冷浸的目的是使营养物质（不溶性蛋白质）充分浸出。②加热一定时间可使蛋白质凝固，加热不足，一部分蛋白质未能凝固，使培养基很难滤清。③当培养基中pit值调好后，需再加热10min，使酸碱度得到稳定，并使沉淀物下沉。（二）营养肉汤（或普通肉汤）成分；牛肉膏0.5g氯化钠0.5g磷酸氢二钾0.1g蛋白陈1g蒸馏水100ml制法：(1)称取牛肉膏、蛋白陈和盐类后，加人100ml水中，加热溶解，调p1-i7.4至7.6,再加热15min，补足水分。(2)凉后用滤纸过滤，分装（肉汤必须完全透明）。(3)置高压灭菌器内，121C高压蒸汽灭菌20min用途：（1）可供一般细菌生长的液体培养基，用其可检查细菌的生长表现。（2）制备固体培养基的基础。注：此培养基可满足一般细菌的营养需要，蛋自陈提供氮素来源，牛肉膏含多种含氮物质（肌酸、嘌呤类腺昔酸、多种氨基酸、肽类）和含碳物质.还有多种矿物元素，氯化钠提供Na、CI.离子维持细菌细胞内外渗透压，磷酸盐缓冲培养基的pH变化，水为细菌细胞内外物质交换的良好溶剂。（三）营养琼脂（或普通琼脂）成分：牛肉膏0.5g氯化钠0.5g磷酸氢二钾0.1g蒸馏水100ml蛋白陈1g琼脂20g制法：(1）取牛肉膏、蛋白陈、盐类加人水中溶解。（2）将琼脂剪碎，后加人肉汤内，加热使之融化。(3）用0.5mol/LNa0H溶液调pH7.4～7.6，煮沸10-15min，补足蒸发水分至原量。（4）用垫有薄层脱脂棉的双层沙布过滤，分装于试管或三角烧瓶内，加塞，包装。(5）121℃高压蒸汽灭菌20min。倒成普通琼脂平板或摆成普通琼脂斜面，备用。用途：(1）可供一般细菌的分离培养、纯培养：观察菌落性状及保存菌种用。(2)为特殊培养基的基础培养基。注：除了琼脂为一种岩藻糖，一般细菌不能分解它，作为培养基的成分，它只起一个支撑作用，对细

附录二 培养基与培养基的制备 （一）牛肉水（牛肉浸出液） 成分： 瘦牛肉 50 g 常水 100 ml 制法： (1) 除去瘦牛肉的脂肪、腱膜、切成小块，用绞肉机绞碎。 (2) 称其重量，加倍量水，浸泡一夜（夏天防止腐败应置冷处）。 (3) 煮沸 1h,在加热煮沸中间，应多次搅拌。 (4) 用纱布滤去肉渣挤出肉水，再用滤纸过滤。 (5) 补足原水量、分装于瓶中，121 C 高压蒸汽灭菌 20min，置冷暗处保存。 注：现多用牛肉膏制备肉水，其浓度为 0. 3％-0. 5％。 用途：制作各种培养基的基础。 注：① 牛肉加水后冷浸的目的是使营养物质（不溶性蛋白质）充分浸出。 ② 加热一定时间可使蛋白质凝固，加热不足，一部分蛋白质未能凝固，使培养基很难滤清。 ③ 当培养基中 pit 值调好后，需再加热 10min,使酸碱度得到稳定，并使沉淀物下沉。 （二）营养肉汤（或普通肉汤） 成分； 牛肉膏 0.5g 氯化钠 0.5g 磷酸氢二钾 0.1g 蛋白胨 lg 蒸馏水 100 ml 制法： (1)称取牛肉膏、蛋白胨和盐类后，加人 100m1 水中，加热溶解，调 p1-i7. 4 至 7. 6,再加热 15min，补 足水分。 (2)凉后用滤纸过滤，分装（肉汤必须完全透明）。 (3)置高压灭菌器内，121 C 高压蒸汽灭菌 20min . 用途： （1）可供一般细菌生长的液体培养基，用其可检查细菌的生长表现。 （2）制备固体培养基的基础。 注：此培养基可满足一般细菌的营养需要，蛋自胨提供氮素来源，牛肉膏含多种含氮物质（肌酸、嘌呤类、 腺昔酸、多种氨基酸、肽类）和含碳物质．还有多种矿物元素，氯化钠提供 Na+、Cl- .离子维持细菌细胞内 外渗透压，磷酸盐缓冲培养基的 pH 变化，水为细菌细胞内外物质交换的良好溶剂。 （三）营养琼脂（或普通琼脂） 成分： 牛肉膏 0.5g 氯化钠 0.5g 磷酸氢二钾 0.1g 蛋白胨 1g 琼脂 20g 蒸馏水 100 ml 制法： ⑴ 取牛肉膏、蛋白胨、盐类加人水中溶解。 ⑵ 将琼脂剪碎，后加人肉汤内，加热使之融化。 ⑶ 用 0. 5mol／LNaOH 溶液调 pH7. 4～7. 6，煮沸 10- 15min，补足蒸发水分至原量。 ⑷ 用垫有薄层脱脂棉的双层沙布过滤，分装于试管或三角烧瓶内，加塞，包装。 ⑸ 121℃高压蒸汽灭菌 20min。倒成普通琼脂平板或摆成普通琼脂斜面，备用。 用途： ⑴ 可供一般细菌的分离培养、纯培养；观察菌落性状及保存菌种用。 ⑵ 为特殊培养基的基础培养基。 注：除了琼脂为一种岩藻糖，一般细菌不能分解它，作为培养基的成分，它只起一个支撑作用，对细

菌培养基中的营养物吸收不受影响，在43C以下，便凝固，因此，它是制备固体培养基不可少的成分。（四）马丁肉汤成分：猪胃消化液50ml1牛肉浸液50ml葡萄糖1g冰醋酸0.1ml醋酸钠0.6gpH7.2-7.4制法：将猪胃消化液和肉浸液混合，加热至80C时，加冰醋酸1ml（，摇匀，煮沸3-5min，约加15%氢氧化钠溶液2ml，调pH值7.2°-7.4，继续煮沸3-5min，加醋酸钠0.6g，再调pH值7.2一7.4，继续煮沸5～10min，用滤纸滤过，滤后补足水至100ml，再加人葡萄糖0.1g，摇匀，分装，121'C高压蒸汽灭菌，备用。用途：(1）可用于分离培养某些生长条件要求较高的细菌，如猪丹毒丝状杆菌。(2）适宜细菌产生毒素，常用于制造毒素或作毒力试验用。（3）可作为某些支原体培养基的基础培养基。注：①猪胃消化液的制备将新鲜猪胃洗净，去脂绞碎，称取35g，加50℃水100ml，充分摇匀，再加人盐酸（CP比重1：19）1ml，充分混合后，置56℃水浴箱中，消化24h（在消化过程中每小时搅拌一次）。24小时后，可见瓶底只留下很少的组织，消化完毕后，80-85℃加热10min，静置并冷却到25-30℃后，虹吸上清液于瓶中，加人1%氯仿充分振荡，然后置2-8℃，用时虹吸出上清液，滤过。②牛肉浸液制法见实验四。绞碎牛肉比例略不同，为牛肉100g，加水150ml。③目前，马丁肉汤中的猪胃消化液及牛肉浸液已被蛋白陈、牛肉浸膏和酵母浸膏代替。（五）血液琼脂或血清琼脂成分：普通琼脂100ml无菌抗凝血液或脱纤血液5ml制法：（1）无菌操作采取健康动物（绵羊或家免）血液，置于盛有玻璃珠的灭菌三角瓶或加有灭菌的5%柠檬酸钠溶液（血液与其比例约为9：1)的三角瓶内，摇动，制成脱纤血或抗凝血或直接从颈静脉或心脏采血，置于灭菌大试管内，使其自然凝固，次日分离血清备用。(2）将灭菌普通琼脂融化待凉至50℃左右，按5%～10%量将血液或血清加人，混匀后倾注于平血或按5%~10%量将血液或血清加人已分装且已灭菌的普通琼脂于试管中摆成斜面，即为鲜血琼脂平板或斜面，或为血清琼脂平板或斜面，备用。(3）将灭菌普通琼脂柱（5ml/管）融化待凉至50℃左右，按5%～10%量将血液或血清加人，混匀后摆成斜面，即为鲜血琼脂斜面，或为血清琼脂斜面，备用。用途（1）常用于标本中病原菌的初次分离，或某些营养条件要求较高病原菌的培养。(2）用以检查细菌的溶血作用。(3）血斜面常用于保存菌种。注：此培养基制作的关键步骤是采取抗凝血液时应确保无菌，加血液或血清时培养基的温度控制在50℃左右，用前无菌检验。（六）巧克力琼脂成分：普通琼脂100ml无菌脱纤血液5ml制法：(1）将普通琼脂融化后加人脱纤血液混合均匀。(2）保持70-80C，10°-20min，使成为巧克力色

菌培养基中的营养物吸收不受影响，在 43 C 以下，便凝固，因此，它是制备固体培养基不可少的成分。 （四）马丁肉汤 成分： 猪胃消化液 50ml 牛肉浸液 50 ml 葡萄糖 1g 冰醋酸 0.1 ml 醋酸钠 0.6 g pH 7.2-7.4 制法： 将猪胃消化液和肉浸液混合，加热至 80 C 时，加冰醋酸 lml(，摇匀，煮沸 3-5min,约加 15％氢氧化 钠溶液 2m1，调 pH 值 7. 2^-7. 4，继续煮沸 3 - 5min，加醋酸钠 0.6g，再调 pH 值 7. 2 一 7. 4，继续煮 沸 5～1 Omin，用滤纸滤过，滤后补足水至 100 ml，再加人葡萄糖 0.lg，摇匀，分装，121'C 高压蒸汽灭 菌，备用。 用途： ⑴ 可用于分离培养某些生长条件要求较高的细菌，如猪丹毒丝状杆菌。 ⑵ 适宜细菌产生毒素，常用于制造毒素或作毒力试验用。 ⑶ 可作为某些支原体培养基的基础培养基。 注： ① 猪胃消化液的制备将新鲜猪胃洗净，去脂绞碎，称取 35g，加 50℃水 100 ml，充分摇匀，再加人盐酸 (CP 比重 1﹕19) lml，充分混合后，置 56℃水浴箱中，消化 24 h(在消化过程中每小时搅拌一次)。24 小 时后，可见瓶底只留下很少的组织，消化完毕后，80-85℃加热 10min，静置并冷却到 25-30℃后，虹吸上 清液于瓶中，加人 1％氯仿充分振荡，然后置 2-8℃，用时虹吸出上清液，滤过。 ② 牛肉浸液制法见实验四。绞碎牛肉比例略不同，为牛肉 100g，加水 150m1。 ③ 目前，马丁肉汤中的猪胃消化液及牛肉浸液已被蛋白胨、牛肉浸膏和酵母浸膏代替。 （五）血液琼脂或血清琼脂 成分： 普通琼脂 100 ml 无菌抗凝血液或脱纤血液 5 ml 制法： ⑴ 无菌操作采取健康动物（绵羊或家兔）血液，置于盛有玻璃珠的灭菌三角瓶或加有灭菌的 5％柠檬酸钠 溶液（血液与其比例约为 9﹕1)的三角瓶内，摇动，制成脱纤血或抗凝血或直接从颈静脉或心脏采血，置 于灭菌大试管内，使其自然凝固，次日分离血清备用。 ⑵ 将灭菌普通琼脂融化待凉至50℃左右，按5% ～10％量将血液或血清加人，混匀后倾注于平皿或按5% ～ 10％量将血液或血清加人已分装且已灭菌的普通琼脂于试管中摆成斜面，即为鲜血琼脂平板或斜面，或为 血清琼脂平板或斜面，备用。 ⑶ 将灭菌普通琼脂柱（5ml/管）融化待凉至 50℃左右，按 5% ～10％量将血液或血清加人，混匀后摆成 斜面，即为鲜血琼脂斜面，或为血清琼脂斜面，备用。 用途 ⑴ 常用于标本中病原菌的初次分离，或某些营养条件要求较高病原菌的培养。 ⑵ 用以检查细菌的溶血作用。 ⑶ 血斜面常用于保存菌种。 注：此培养基制作的关键步骤是采取抗凝血液时应确保无菌，加血液或血清时培养基的温度控制在 50℃ 左右，用前无菌检验。 （六）巧克力琼脂 成分： 普通琼脂 100 ml 无菌脱纤血液 5 ml 制法： ⑴ 将普通琼脂融化后加人脱纤血液混合均匀。 ⑵ 保持 70-80'C，10^-20min，使成为巧克力色

(3）待冷至50,C倾注平板，无菌检验后置冰箱备用。用途：（1）可供给某些细菌（如嗜血杆菌）的促生长物质如X因子和V因子，疑为嗜血杆菌属的细菌分离培养常用的培养基。(2）具有中和脑膜炎双球菌等毒素作用。（七）半固体琼脂成分：普通肉汤100ml琼脂0.8g制法：（1）将琼脂加人定量普通肉汤中，加热融化后分装于试管中。(2）高压蒸汽灭菌后将试管直立让琼脂凝固。用途：（1）测定细菌的运动性。如有运动力的细菌，可自穿刺线向四周弥散性生长，无运动力的细菌仅沿着穿刺线生长。(2）保存菌种，对营养要求不高的细菌，穿刺培养后于其表面滴加一薄层灭菌液体石蜡，在普通冰箱中可保存3个月左右。（八）胰化大豆琼脂成分：胰化蛋白陈1.5g琼脂1.5g氯化钠0.5g蒸馏水100ml制法：将上述成分混合加热溶解，调pH至7.3，过滤分装，121℃高压蒸汽灭菌24min。用途：用来分离娇细的细菌用培养基，可以替代营养琼脂。（九）STUART运送培养基成分：20%甘油磷酸钠5ml0.1%美蓝0.2ml硫羟代乙酸0.1ml1%氯化钙1ml蒸馏水100ml琼脂0.2g制法：（1）溶解琼脂于50ml水中，让其冷至55'C。（2）将其余成分，除美蓝外，加人到40ml水中，用1mol/LNa0H调pH至7.2，加热至55℃C。(3）将上述溶液混合，调pH至7.3一7.4，最后加人美蓝。用途为一种缓冲的无营养的半固体培养基。临床标本运送到实验室过程中作为菌体的保护剂。（十）邓亨氏蛋白陈水成分：蛋白陈1g氯化钠0.5g蒸馏水100ml制法：(1）将蛋白陈与氯化钠加人蒸馏水中，加热溶解后调pH为7.6，再煮沸加热30min。(2）待冷后用滤纸过滤，分装，121℃高压蒸汽灭菌15min。用途：（1）检查靛基质（即吲哚）用（靛基质试验用）(2)制备糖发酵培养基的基础液。注：一些细菌，如大肠杆菌可以分解蛋白陈中的色氨酸生成吲哚，后者与对二甲基氨基苯甲醛作用，形

⑶ 待冷至 50,C 倾注平板，无菌检验后置冰箱备用。 用途： ⑴ 可供给某些细菌（如嗜血杆菌）的促生长物质如 X 因子和 V 因子，疑为嗜血杆菌属的细菌分离培养常 用的培养基。 ⑵ 具有中和脑膜炎双球菌等毒素作用。 （七）半固体琼脂 成分： 普通肉汤 100 ml 琼脂 0.8g 制法： ⑴ 将琼脂加人定量普通肉汤中，加热融化后分装于试管中。 ⑵ 高压蒸汽灭菌后将试管直立让琼脂凝固。 用途： ⑴ 测定细菌的运动性。如有运动力的细菌，可自穿刺线向四周弥散性生长，无运动力的细菌仅沿着穿刺 线生长。 ⑵ 保存菌种，对营养要求不高的细菌，穿刺培养后于其表面滴加一薄层灭菌液体石蜡，在普通冰箱中可 保存 3 个月左右。 （八）胰化大豆琼脂 成分： 胰化蛋白胨 1.5g 琼脂 1.5 g 氯化钠 0.5g 蒸馏水 100 ml 制法： 将上述成分混合加热溶解，调 pH 至 7.3，过滤分装，121℃高压蒸汽灭菌 24min。 用途： 用来分离娇细的细菌用培养基，可以替代营养琼脂。 （九）STUART 运送培养基 成分： 20％甘油磷酸钠 5 ml 0.1％美蓝 0.2 ml 硫羟代乙酸 0.1 ml 1％氯化钙 1ml 蒸馏水 100 ml 琼脂 0.2g 制法： ⑴ 溶解琼脂于 50ml 水中，让其冷至 55'C。 ⑵ 将其余成分，除美蓝外，加人到 40ml 水中，用 1 mol /L NaOH 调 pH 至 7. 2，加热至 55℃。 ⑶ 将上述溶液混合，调 pH 至 7. 3 一 7.4，最后加人美蓝。 用途 为一种缓冲的无营养的半固体培养基。临床标本运送到实验室过程中作为菌体的保护剂。 （十）邓亨氏蛋白胨水 成分： 蛋白胨 1g 氯化钠 0. 5 g 蒸馏水 100 ml 制法： ⑴ 将蛋白胨与氯化钠加人蒸馏水中，加热溶解后调 pH 为 7. 6，再煮沸加热 30min。 ⑵ 待冷后用滤纸过滤，分装，121℃高压蒸汽灭菌 15min。 用途： ⑴ 检查靛基质（即吲哚）用（靛基质试验用） ⑵ 制备糖发酵培养基的基础液。 注：一些细菌，如大肠杆菌可以分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，后者与对二甲基氨基苯甲醛作用，形

成玫瑰吲哚而呈红色。（十一）糖培养基成分：pH7.6的邓亨氏蛋白陈水100ml1.6%溴甲酚紫酒精溶液0.1ml50%糖1-2ml制法（1）取定量邓亨氏蛋白陈水，按以上比例加人指示剂，分装于带有小发酵管的试管中，以115'C高压蒸汽灭菌20min即可。（2）无菌方法在每个含有培养基的试管中，加入50%（灭菌或过滤除菌处理的）相应的糖溶液1ml。(3）进行营养要求苛刻细菌的糖发酵试验，可在每管培养基中无菌操作加1一2滴灭活无菌健康马血清。用途鉴定细菌对糖类的发酵能力。（十二）厌氧菌用糖培养基成分：蛋白陈2g氯化钠0.5g蒸馅水100ml硫乙醇酸钠0.1g糖类1g琼脂0.5g1.6%溴甲酚紫酒精溶液0.1ml制法：(1）将蛋白陈、氯化钠、硫乙醇酸钠、琼脂和水，加热溶解，再加所需糖。(2）调p11至7.0，加人指示剂，分装试管（做成高层）。灭菌方法同上。（3）将厌氧菌以穿刺方法接种于试管培养基深部，于37C培养，观察结果。注：培养基成分中的硫乙醇酸钠为还原剂，降低培养基中的氧化电势，有利于厌氧菌的生长。（十三）葡萄糖蛋白陈水成分：蛋白陈1g磷酸氢二钾0.1g葡萄糖1g蒸馏水200ml制法：（1）将上述材料依次加人蒸馏水中，加热溶解。(2）调PH至7.4，加热100C10-15min，放凉，滤纸过滤，分装于试管中，1巧c高压汽灭菌15~20min。用途M.R试验及V.P试验用，主要用于鉴别大肠杆菌和产气杆菌。其原理见细菌实验八，M.R和V.P试验。（十四）紫乳或石蕊牛乳培养基成分：脱脂牛乳一50ml1.6%溴甲酚紫酒精溶液0.05ml制法：（1）取新鲜牛乳（也可用奶粉配制成10%水溶液代替），加热或离心去掉脂肪。(2）将指示剂加人脱脂牛乳内，分装于小试管中，以115C高压蒸汽灭菌20min。用途：测定细菌产酸，产碱的能力。检查细菌对牛乳的凝固性状及陈化特性。（十五）美蓝牛乳成分：脱脂牛乳100ml1%美蓝水溶液2ml制法：与紫乳制法相同。用途：测定细菌有无还原美蓝的能力

成玫瑰吲哚而呈红色。 （十一）糖培养基 成分： pH7.6 的邓亨氏蛋白胨水 100 ml 1.6％溴甲酚紫酒精溶液 0.1ml 50% 糖 1-2ml 制法 ⑴ 取定量邓亨氏蛋白胨水，按以上比例加人指示剂，分装于带有小发酵管的试管中，以 115'C 高压蒸汽 灭菌 20min 即可。 ⑵ 无菌方法在每个含有培养基的试管中，加入 50%（灭菌或过滤除菌处理的）相应的糖溶液 1ml。 ⑶ 进行营养要求苛刻细菌的糖发酵试验，可在每管培养基中无菌操作加 1 一 2 滴灭活无菌健康马血清。 用途 鉴定细菌对糖类的发酵能力。 （十二）厌氧菌用糖培养基 成分： 蛋白胨 2g 氯化钠 0.5g 蒸馏水 100 ml 硫乙醇酸钠 0. 1 g 糖类 1g 琼脂 0. 5 g 1. 6％溴甲酚紫酒精溶液 0. 1 ml 制法： ⑴ 将蛋白胨、氯化钠、硫乙醇酸钠、琼脂和水，加热溶解，再加所需糖。 ⑵ 调 p11 至 7.0，加人指示剂，分装试管（做成高层）。灭菌方法同上。 ⑶ 将厌氧菌以穿刺方法接种于试管培养基深部，于 37 C 培养，观察结果。 注：培养基成分中的硫乙醇酸钠为还原剂，降低培养基中的氧化电势，有利于厌氧菌的生长。 （十三）葡萄糖蛋白胨水 成分： 蛋白胨 1g 磷酸氢二钾 0. 1 g 葡萄糖 1g 蒸馏水 200 ml 制法： ⑴ 将上述材料依次加人蒸馏水中，加热溶解。 ⑵ 调 PH 至 7. 4,加热 100 C 10- 15min,放凉，滤纸过滤，分装于试管中，1 巧 c 高压汽灭菌 15～20min。 用途 M. R 试验及 V. P 试验用，主要用于鉴别大肠杆菌和产气杆菌。其原理见细菌实验八，M. R 和 V. P 试验。 （十四）紫乳或石蕊牛乳培养基 成分： 脱脂牛乳一 50ml 1.6％溴甲酚紫酒精溶液 0. 05ml 制法： ⑴ 取新鲜牛乳（也可用奶粉配制成 10％水溶液代替），加热或离心去掉脂肪。 ⑵ 将指示剂加人脱脂牛乳内，分装于小试管中，以 115 C 高压蒸汽灭菌 20min。 用途： 测定细菌产酸，产碱的能力。检查细菌对牛乳的凝固性状及胨化特性。 （十五）美蓝牛乳 成分： 脱脂牛乳 100 ml 1％美蓝水溶液 2 ml 制法： 与紫乳制法相同。 用途： 测定细菌有无还原美蓝的能力