《微生物学实验》课程教学资源（实验指导）显微镜油镜的使用及细菌革兰氏染色

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显微镜油镜的使用及 细菌革兰氏染色

,一、目的要求 ● 1、理解显微镜油镜的使用原理，掌握显微镜油镜的使用方法； 2、掌握细菌的革兰氏染色法。 二、基本原理 1.显微镜 ·显微镜是进行微生物研究的最基础设备。 一般由机械部分和光学系统两部分组成，机械部分作为显微镜 光学部分的支撑和调节，调节部分的精密程度是决定显微镜质 量首要条件；光学系统由一组透镜构成，包括透镜成像部分和 照明部分，是显微镜的最关键部分，决定了成像的质量。 ·一台显微镜的质量是由显微镜的放大倍数和数值口径决定

• 一、目的要求 • 1、理解显微镜油镜的使用原理，掌握显微镜油镜的使用方法； • 2、掌握细菌的革兰氏染色法。 • 二、基本原理 • 1.显微镜 • 显微镜是进行微生物研究的最基础设备。 • 一般由机械部分和光学系统两部分组成，机械部分作为显微镜 光学部分的支撑和调节，调节部分的精密程度是决定显微镜质 量首要条件；光学系统由一组透镜构成，包括透镜成像部分和 照明部分，是显微镜的最关键部分，决定了成像的质量。 • 一台显微镜的质量是由显微镜的放大倍数和数值口径决定

一观察镜筒 一镜篱安全细 我物台 5转换福 一使臂 6物镀 X压片夹 、物使 尖载物台 0速光器 .反光镜 显微镜底座 光强满节旋细 显微镜工作原理

显微镜结构 显微镜工作原理

分辨力(resolution)》 ·分辨力是指显微镜（或人的眼晴距目标25cm处）能分辨物体最小间隔 (distance)的能力。显微镜的分辨力由物镜的分辨力来决定的，物镜分 辨力的大小决定于光的波长和镜口率NA,用公式表示为： .D=0.61/N.A.N.A.=nsina/2 ·式中：η介质折射率；α镜口角（标本对物镜镜口的张角），NA镜口 率(numeric aperture)。镜口角总是要小于l80°，所以sina/2的最大值 必然小于1。 11 介质和 水和 香柏油 石蜡油 a-溴萘 玻璃 折射率和 1.33 1.515 1.471 1.66 1.52 空气n=1.00

分辨力（resolution） • 分辨力是指显微镜（或人的眼睛距目标25cm处）能分辨物体最小间隔 (distance)的能力。显微镜的分辨力由物镜的分辨力来决定的，物镜分 辨力的大小决定于光的波长λ和镜口率NA，用公式表示为： • D=0.61λ /N.A． N.A.＝ηsinα/2 • 式中：η介质折射率；α镜口角（标本对物镜镜口的张角），N.A.镜口 率（numeric aperture）。镜口角总是要小于1800，所以sina/2的最大值 必然小于1

·2.革兰氏染色 ·用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三 大类。碱性染料有如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等；酸 性染料有伊红、酸性复红或刚果红等；中性染料是前两者的结 合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 ·革兰氏染色法是细菌学上最常用的重要的鉴别染色法。该 染色法能将细菌分为G+菌和G-菌，原理是由这两类菌的细 胞壁结构和成分的不同所决定的。 八以一沙一》→沙 (a)Application of (b)Application of (c)Akcohol wash (d)Application of crystal violet iodine safranin 总性陶 落兰阴性离 (G)

• 2.革兰氏染色 • 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三 大类。碱性染料有如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等；酸 性染料有伊红、酸性复红或刚果红等；中性染料是前两者的结 合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 • 革兰氏染色法是细菌学上最常用的重要的鉴别染色法。该 染色法能将细菌分为G+菌和G-菌，原理是由这两类菌的细 胞壁结构和成分的不同所决定的

三、仪器与材料 ·1、菌种 培养12~16h枯草杆菌(Bacillus subtilis) 培养24h的大肠杆菌(Escherichia coli) 2、染色液和试剂 结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红； 二甲苯、香柏油 3、器材 显微镜；接种杯、酒精灯、擦镜纸、吸水纸 废液缸、洗瓶、载玻片

三、仪器与材料 • 1、菌种 培养12～16 h枯草杆菌（Bacillus subtilis） • 培养24 h的大肠杆菌（Escherichia coli） 2、染色液和试剂 结晶紫、卢哥氏碘液、95 %酒精、蕃红； • 二甲苯、香柏油 3、器材 显微镜；接种杯、酒精灯、擦镜纸、吸水纸 • 废液缸、洗瓶、载玻片

四、操作步骤 (1)涂片在干净的载玻片上滴上一小滴水，用无菌操作挑一环菌于 水中，涂成薄而均匀的薄膜； (2)晾干室温下自然风干： (3)固定在酒精灯火焰上通过2-3次，每次不烫手为宜： (4)结晶紫色染色在玻片均有涂布区上加适量（以盖满细菌涂面） 的结晶紫染色液，染色lmin后，倾去染色液，用水小心地冲洗； (5)媒染滴加卢哥氏碘液，媒染lmin水洗去碘液； (6)脱色将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇，脱色20s~25s,至流出 液无色，立即水洗： (7)复染滴加蕃红，复染1min;水洗去染色液： (8)晾干将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干； (9)镜检镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌 体的革兰氏染色反应性；

四、操作步骤 （1）涂片 在干净的载玻片上滴上一小滴水，用无菌操作挑一环菌于 水中，涂成薄而均匀的薄膜； （2）晾干 室温下自然风干； （3）固定 在酒精灯火焰上通过2-3次，每次不烫手为宜； （4）结晶紫色染色 在玻片均有涂布区上加适量（以盖满细菌涂面） 的结晶紫染色液，染色1 min后，倾去染色液，用水小心地冲洗； （5）媒染 滴加卢哥氏碘液，媒染1 min；水洗去碘液； （6）脱色 将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇，脱色20s～25s，至流出 液无色，立即水洗； （7）复染 滴加蕃红，复染1min；水洗去染色液； （8）晾干 将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干； （9）镜检 镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌 体的革兰氏染色反应性；

长正 实验要点和关键 ·1、玻片干净，水小，挑 菌要少，涂片要薄而均匀； ·2、无菌操作 ·3、成败的关键步骤是脱 色

实验要点和关键 • 1、玻片干净，水小，挑 菌要少，涂片要薄而均匀； • 2、无菌操作 • 3、成败的关键步骤是脱 色

五、实验报告 ·1、绘制所观察菌的形态图，并注明菌的革 兰氏染色的反应性。 ·2、显微镜的操作要点是什么？ ·3、为什么说脱色是革兰氏染色的关键？

五、实验报告 • 1、绘制所观察菌的形态图，并注明菌的革 兰氏染色的反应性。 • 2、显微镜的操作要点是什么？ • 3、为什么说脱色是革兰氏染色的关键？

肽聚糖和磷壁酸 ◆ 细胞质膜 G菌细胞壁 脂多糖 B 外壁层 脂蛋白 肽聚糖 类脂 细胞质膜 G菌细胞壁 A.革兰氏阳性菌的细胞壁B.革兰氏阴性菌的细胞壁