南方医科大学：《抗体工程》课程教学资源（讲稿）转基因小鼠技术——靶细胞的获取

靶细胞的获 取

靶细胞的获 取

3 -2 转基因动物构建需要的靶细胞的分类 受精卵 精子载体法 B 胚胎干细胞 体细胞核移植 (ES细胞)

转基因动物构建需要的靶细胞的分类 受精卵 A 精子载体法 C 胚胎干细胞 （ES细胞） B D 体细胞核移植

转基因的 靶细胞 1.受精卵 受精卵可以通过小鼠自然 交配得到，但数量常不能 0-8-88 得到保证。因而需对雌鼠 施以激素以获得足够数量 的受精卵， 即诱导超排 卵。 ntips://www.wps.cn

https ://www.wps. cn 转基因的 靶细胞 1.受精卵 受精卵可以通过小鼠自然 交配得到，但数量常不能 得到保证。因而需对雌鼠 施以激素以获得足够数量 的受精卵——即诱导超排 卵

超排 不同背景的小鼠超排周龄都是不同的，剂量也是不同的。那以常用的C57 小鼠为例，超排周龄为3-4周龄。当达到超排周龄后，向雌小鼠腹腔内注射5 个国际单位(U)的孕马血清促性腺激素(PMSG),然后约46-48h后再注射5U 的人绒毛膜促性腺激素(hCG),12h后即可诱发排卵。 PMSG HCG E0.5 E1.5 E2.5 E3.5 E4.5 E5.5 42-48h Zona pellucida Embryo 交配 Recovery 雌小鼠给予hCG后与成熟雄性小鼠进行合笼。雄鼠交配一般是在夜晚发生，交配 过程中建议不换笼，交配过的雄小鼠，间隔一周后才进行下次交配。交配后过夜 易见小鼠的阴道栓

超排 不同背景的小鼠超排周龄都是不同的，剂量也是不同的。那以常用的C57 小鼠为例，超排周龄为3-4周龄。当达到超排周龄后，向雌小鼠腹腔内注射5 个国际单位(IU)的孕马血清促性腺激素(PMSG)，然后约46-48h后再注射5 IU 的人绒毛膜促性腺激素(hCG)，12h后即可诱发排卵。 交配 雌小鼠给予hCG后与成熟雄性小鼠进行合笼。雄鼠交配一般是在夜晚发生，交配 过程中建议不换笼，交配过的雄小鼠，间隔一周后才进行下次交配。 交配后过夜 易见小鼠的阴道栓

1)受精卵的获取 哺乳动物的受精过程发生在输卵管内，小鼠胚胎进入子宫着床时间大约为4天左右。 因此，需要在配种后或受精后的适当时间从超排供体收集不同时期的胚胎。 小鼠受精后4.5天内早期胚胎发育的过程： 收取受精卵的时间点： 2 E2.75 E30 E45 见栓0.5天的小鼠 -ca ·收集高质量的受精卵，才能更有效地进行显微注射、胚胎移植或冻存复苏，保证获得高质 量的子代小鼠

• 收集高质量的受精卵，才能更有效地进行显微注射、胚胎移植或冻存复苏，保证获得高质 量的子代小鼠 1）受精卵的获取 哺乳动物的受精过程发生在输卵管内，小鼠胚胎进入子宫着床时间大约为4天左右。 因此，需要在配种后或受精后的适当时间从超排供体收集不同时期的胚胎。 小鼠受精后4.5天内早期胚胎发育的过程： 收取受精卵的时间点： 见栓0.5天的小鼠

输卵管切开 (A) Fatpad 1)通过断颈快速处死见栓0.5天的小鼠。 Ovary Poke hole in mesometrium Oviduct close to oviduct with tip of closed forceps or scissors 2)将小鼠背部靠尾部剃毛并用70%的乙醇彻底涂搽手 术部位。 3)用眼科镊捏紧正中线皮肤，用外科剪剪出一个横切 Pull back Mesometrium or membrane 口，钝性分离皮肤与肌肉，充分暴露背侧腰部肌肉。 Uterus carrying prominent blood vessel 4)卵巢位于脊柱两侧隐约可见的白色脂肪团的下方， 用眼科镊拎起脂肪团上腹膜，眼科剪在此处开一小口， 用镊子夹住脂肪垫，轻轻地将子宫、输卵管、卵巢拉出 (B) Reposition 体腔。 forceps Cut 5)用眼科镊将输卵管、卵巢和脂肪团拉伸，用眼科剪 Cut between oviduct and ovary with fine scissors 在输卵管和卵巢之间剪开，重新定位眼科镊的位置，然 Pull back iduct 后在靠近输卵管的子宫部剪开，将断离的输卵管放入预 先准备好的小玻璃皿中的M2液滴中。对另一侧输卵管 重复上面操作

输卵管切开 1） 通过断颈快速处死见栓0.5天的小鼠。 2） 将小鼠背部靠尾部剃毛并用70%的乙醇彻底涂搽手 术部位。 3） 用眼科镊捏紧正中线皮肤，用外科剪剪出一个横切 口，钝性分离皮肤与肌肉，充分暴露背侧腰部肌肉。 4） 卵巢位于脊柱两侧隐约可见的白色脂肪团的下方， 用眼科镊拎起脂肪团上腹膜，眼科剪在此处开一小口， 用镊子夹住脂肪垫，轻轻地将子宫、输卵管、卵巢拉出 体腔。 5） 用眼科镊将输卵管、卵巢和脂肪团拉伸，用眼科剪 在输卵管和卵巢之间剪开，重新定位眼科镊的位置，然 后在靠近输卵管的子宫部剪开，将断离的输卵管放入预 先准备好的小玻璃皿中的 M2 液滴中。对另一侧输卵管 重复上面操作

Transfer capillary 体输卵管内受精卵的收集与处理 Capillary holder Mouth pie 1)用眼科摄撕开输卵管膨大的壶腹部，即看到包绕受精卵 的丘细胞团。游离的受精卵慢慢流出，也可以用镊子轻轻挤 Sterile filter 压输卵管将受精卵推出裂口。 ubing 2)全部卵群取出后，将其转移到一个约200u1的液滴中 加入10-15ul的500U/ml透明质酸酶(hyaluronidase)消化 颗粒细胞，约30秒-1分钟，必要时用毛细管吹打卵群数次。 b 如颗粒细胞全部脱落，则开始清洗步骤；如仍有部分未脱落 则再等待数十秒直到全部脱落。 3)洗涤：用玻璃细管（直径约120um-250um,即大于一个 受精卵的直径而小于二个受精卵的直径)把受精卵在新的M2 液滴中转移五次，洗去颗粒细胞、残渣及透明质酸酶，将洗 M2 medium 好的受精卵转移到覆盖有矿物油（可防止污染同时防止培养 基水分蒸发影响pH)的M16液滴（在5%CO2、37℃培养箱 中平衡过夜，保证正确pH值)中，再放入5%C02、37℃ 培养箱中备用

体输卵管内受精卵的收集与处理 1） 用眼科镊撕开输卵管膨大的壶腹部，即看到包绕受精卵 的丘细胞团。游离的受精卵慢慢流出，也可以用镊子轻轻挤 压输卵管将受精卵推出裂口。 2） 全部卵群取出后，将其转移到一个约 200ul 的液滴中， 加入 10-15ul 的 500U/ml 透明质酸酶（hyaluronidase）消化 颗粒细胞，约30秒-1分钟，必要时用毛细管吹打卵群数次。 如颗粒细胞全部脱落，则开始清洗步骤；如仍有部分未脱落 则再等待数十秒直到全部脱落。 3） 洗涤：用玻璃细管（直径约120um-250um，即大于一个 受精卵的直径而小于二个受精卵的直径）把受精卵在新的 M2 液滴中转移五次，洗去颗粒细胞、残渣及透明质酸酶，将洗 好的受精卵转移到覆盖有矿物油（可防止污染同时防止培养 基水分蒸发影响pH）的 M16 液滴（在 5%CO2、37℃培养箱 中平衡过夜，保证正确 pH 值）中，再放入 5%CO2、37℃ 培养箱中备用

受精卵专用培养基 M2和M16培养基 化学诚份 M16 (mmol/L) NaCl 95.00 M2与M16都是化学成份明确的培养基（chemically defined medium;CDM)。CDM含胚胎需要、能维持和 KCL 4.80 胚胎生长发育，分裂繁殖的化学成分：多种盐离子、能 KH2PO4 1.20 量物质、生长因子、动物白蛋白或含蛋白等大分子的各 NaHCO3 25.00 种动物血清。 CaCL2 1.70 标准的M16在上世纪70年代初定型，现已商业化，是世 MgSO 1.20 界各地实验室仍常用于小鼠胚胎实验的一种CDM。M2是 在M16基础上添加了HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)。利 Na-lactate 23.00 用HEPES可适当延长培养基和其中培养物在自然环境下 Na-pyruvate 0.33 (二氧化碳培养箱外)的使用时间。因其可较长时间维持一 Glucose 5.60 定的H平衡，便于自然环境下操作应用。M2更适于小鼠 等动物在采集卵母细胞，或胚胎在相对较长时间的体外 BSA(mg/ml) 4.00 操作等环节应用。 Osmolarity (mOsm) 290

M2 和 M16培养基 M2与M16都是化学成份明确的培养基（chemically defined medium；CDM）。CDM含胚胎需要、能维持和 胚胎生长发育，分裂繁殖的化学成分：多种盐离子、能 量物质、生长因子、动物白蛋白或含蛋白等大分子的各 种动物血清。 标准的M16在上世纪70年代初定型，现已商业化，是世 界各地实验室仍常用于小鼠胚胎实验的一种CDM。M2是 在M16基础上添加了HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)。利 用HEPES可适当延长培养基和其中培养物在自然环境下 (二氧化碳培养箱外)的使用时间。因其可较长时间维持一 定的pH平衡，便于自然环境下操作应用。M2更适于小鼠 等动物在采集卵母细胞，或胚胎在相对较长时间的体外 操作等环节应用。 受精卵专用培养基

LOGO 2.胚胎干 ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养 细胞 建立起来的多潜能细胞系。 (ES细胞) 它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性， 可以形成包括几乎所有细胞类型在内的所有组织，并且 在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。 ●将携带有外源基因的ES细胞注入到动物的早期胚胎 内，可产生嵌合体转基因动物。 https://www.wps.cn

l ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养 建立起来的多潜能细胞系。 它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性， 可以形成包括几乎所有细胞类型在内的所有组织，并且 在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。 ● 将携带有外源基因的ES细胞注入到动物的早期胚胎 内，可产生嵌合体转基因动物。 LOGO h t t p s : / / w w w . w p s . c n 2.胚胎干 细胞 （ES细胞）

ES的特点： (1)全能性 这个特点是E$细胞具有可塑性的基础。 (2)无限扩增 为实验和应用提供了大量的原材料或工具。 (3)可操作性 导入异源基因，报告基因或标志基因，诱导某个 基因突变，基因打靶或导入额外的原有基因使之 过度表达

1）全能性 这个特点是ES细胞具有可塑性的基础。 （2）无限扩增 为实验和应用提供了大量的原材料或工具。 （3）可操作性 导入异源基因，报告基因或标志基因，诱导某个 基因突变，基因打靶或导入额外的原有基因使之 过度表达