《食品安全学》课程教学资源（实验指导）实验二 发酵法检验大肠菌群实验

实验二发酵法检验大肠菌群实验 一、实验目的 1.了解检验大肠菌群的重要意义： 2.掌握发酵法检验大肠菌群的原理及方法。 二、 实验原理 大肠菌群系指一群在37℃下24内能发酵乳糖产酸、产气的需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆 菌。该菌群主要来源于人畜粪便，故经此作为粪便污染指标，来评价食品卫生质量，具有广泛的卫 生学意义。 食品中大肠菌群数是以每100mL(g)检样大肠菌群最近似数(MP.N)来表示。据此含义，所有 食品卫生标准中所规定的大肠菌群数均应为100L(g)食品内允许含有大肠菌群的实际数值，而不 再以发现大肠菌群的最小样品限量为报告标准。 三、材料 1样品 乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。 2.菌种 大肠埃希氏菌(Escherichia coli) 产气肠杆菌(Enterobacteria aerogenes.) 3.培养基及试剂 单料乳糖胆盐发酵管、双料乳糖胆盐发酵管、乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂(EMB)、革兰氏 染色液。 4.其它 恒温箱、恒温水浴、药物天平、培养皿、载玻片等。 四、实验步骤 1.发酵试验 在无菌操作条件采集样品，采样量及稀释倍数可以根据国家当地卫生标准的要求和样品的污染情 况而定。将被检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1L以上，可用双料乳糖胆盐发酵管；1mL 及1mL以下，可用单料乳糖胆盐发酵管，例如，乳制品将细菌总数检验中1：10稀释液10mL接种于双 料乳糖胆盐发酵管内，将1：100稀释液1L接种于单料乳糖胆盐发酵管内。每一稀释度接种三管，置 于35-37℃温箱内培养24士2，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告大肠菌群阴性，如有产气 者，则按下列程序进行检验： 2.分离培养 将产气的发酵管分别转种在麦康凯琼脂平板（也可采用伊红美蓝琼脂平板或远藤氏琼脂平板） 上，任选一种，置于35-37℃温箱内，培养18-24h,然后取出作菌落形态、革蓝氏染色、镜检和乳糖 复发酵试验。 如果在平板上发现大肠菌群，那么在各种平板上呈现出菌形态。 在伊红美蓝琼脂平板上：大肠杆菌呈涤蓝黑具有金属光泽的菌落：产气杆菌呈灰棕色，稍粘无闪 光菌落。 在远藤氏平板上：大肠杆菌呈紫铜色，小菌落扁平状；产气杆菌为色谈粉红色菌落鼓起稍粘。 在麦康凯平板上：大肠杆菌呈粉红色菌落；约1.5-2mm的产气杆菌，呈粉红色大菌落，稍粘，菌落 突起，如在室温继续培养24h,红色能褪去。 3.复发酵试验 在上述平板上，挑起大肠菌群可疑菌落1-2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置于35-37℃温 箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖发酵管产酸、产气，并镜检为革蓝氏染色为阴性无芽孢杆 菌，即可报告为大肠菌群阳性；如乳糖管不产气或革蓝氏染色阳性，则报告为大肠菌群阴性。 五、报告 以大肠菌群阳性反应的管数，查对表1大肠菌群最近似数(MP.N)检索表，作出报告。 如果乳制品中样品充许10mL(1:100稀释液)检样管1支或1mL(1:100稀释液)检样管1支为阳性管，此均属符合 标准。若发现有2管以上同时为阳性管者，均为超过标准

实验二 发酵法检验大肠菌群实验 一、实验目的 1.了解检验大肠菌群的重要意义； 2.掌握发酵法检验大肠菌群的原理及方法。 二、实验原理 大肠菌群系指一群在37℃下24h内能发酵乳糖产酸、产气的需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆 菌。该菌群主要来源于人畜粪便，故经此作为粪便污染指标，来评价食品卫生质量，具有广泛的卫 生学意义。 食品中大肠菌群数是以每100mL（g）检样大肠菌群最近似数（M.P.N）来表示。据此含义，所有 食品卫生标准中所规定的大肠菌群数均应为100mL（g）食品内允许含有大肠菌群的实际数值，而不 再以发现大肠菌群的最小样品限量为报告标准。 三、材料 1.样品 乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。 2.菌种 大肠埃希氏菌（Escherichia coli） 产气肠杆菌（Enterobacteria aerogenes） 3.培养基及试剂 单料乳糖胆盐发酵管、双料乳糖胆盐发酵管、乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂（EMB）、革兰氏 染色液。 4.其它 恒温箱、恒温水浴、药物天平、培养皿、载玻片等。 四、实验步骤 1.发酵试验 在无菌操作条件采集样品，采样量及稀释倍数可以根据国家当地卫生标准的要求和样品的污染情 况而定。将被检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上，可用双料乳糖胆盐发酵管；1mL 及1mL以下，可用单料乳糖胆盐发酵管，例如，乳制品将细菌总数检验中1:10稀释液10mL接种于双 料乳糖胆盐发酵管内，将1:100稀释液1mL接种于单料乳糖胆盐发酵管内。每一稀释度接种三管，置 于35-37℃温箱内培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告大肠菌群阴性，如有产气 者，则按下列程序进行检验； 2.分离培养 将产气的发酵管分别转种在麦康凯琼脂平板（也可采用伊红美蓝琼脂平板或远藤氏琼脂平板） 上，任选一种，置于35-37℃温箱内，培养18-24h，然后取出作菌落形态、革蓝氏染色、镜检和乳糖 复发酵试验。 如果在平板上发现大肠菌群，那么在各种平板上呈现出菌形态。 在伊红美蓝琼脂平板上：大肠杆菌呈涤蓝黑具有金属光泽的菌落；产气杆菌呈灰棕色，稍粘无闪 光菌落。 在远藤氏平板上：大肠杆菌呈紫铜色，小菌落扁平状；产气杆菌为色谈粉红色菌落鼓起稍粘。 在麦康凯平板上：大肠杆菌呈粉红色菌落；约1.5-2mm的产气杆菌，呈粉红色大菌落，稍粘，菌落 突起，如在室温继续培养24h，红色能褪去。 3.复发酵试验 在上述平板上，挑起大肠菌群可疑菌落1-2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置于35-37℃温 箱内培养24±2h，观察产气情况。凡乳糖发酵管产酸、产气，并镜检为革蓝氏染色为阴性无芽孢杆 菌，即可报告为大肠菌群阳性；如乳糖管不产气或革蓝氏染色阳性，则报告为大肠菌群阴性。 五、报告 以大肠菌群阳性反应的管数，查对表1大肠菌群最近似数（M.P.N）检索表，作出报告。 如果乳制品中样品充许10mL（1:100稀释液）检样管1支或1mL（1:100稀释液）检样管1支为阳性管，此均属符合 标准。若发现有2管以上同时为阳性管者，均为超过标准