厦门大学：《现代生物实验学》课程教学资源（教案讲义）三、微生物学与免疫学实验准备.doc_大学文库

实验安排第 1 次实验：培养基的制备与灭菌，土壤中细菌的分离、纯化下午：配牛肉膏蛋白胨培养基、分装无菌水、准备移液管晚上：分离培养两天，而后分离平板放冰箱，下周观察，不安排课后时间。(冰箱不够考虑借！)，6 板/组(2 人)，测定 10-4 ×3，10-5×3，1mL 量第 2 次实验：分离、纯化，下午：观察、计数、纯化（平板到斜面，每人两支斜面；混菌划线：大肠，滕黄微球菌和自己分离的红色细菌，4 板/组）实际：本预计三种颜色菌落较为好看，但由于红色细菌量明显占优势，平板上以红色细菌为主，较少的平板能显示三色菌落。建议以后还是只有两种，用藤黄和大肠。晚上：（空）第 3 次实验：G 染色，芽胞染色，（接种时，试管上标号不用中文名称，用代号标识，同一菌株，不同标识，单双号区分不同菌株！准备放线菌土壤，凉一个月）下午：挑混菌划线平板到斜面（3 支/人，3 种菌株），用平板上菌落染色，老师再提供大肠，金葡两标准株作革蓝氏染色，实际：教师两株（大肠，金葡），学生两株（划线平板上菌落红色细菌，藤黄大肠或大肠）建议平板到斜面用 3 支/人，混菌划线用 2 支/人，晚上：芽胞染色，用学生土壤分离之斜面染色，老师提供枯草作标准。实际：教师一支（枯草），学生两支（平板倾注得来）第 4 次实验：大分子水解，糖发酵，IMViC

下午：配培养基，淀粉水解培养基（2 板/组）（每板接大肠枯草和学生一支），乳糖发酵培养基（两支/组对付两菌大肠枯草，菌种由老师提供），柠檬酸培养基(三支/组对付两菌大肠枯草，菌种由老师提供，另一支接学生分离之菌种)， VP 培养基(两支/组对付两菌大肠枯草，菌种由老师提供)，晚上：接种

第 5 次实验：大分子水解，糖发酵，IMViC 讲解观察生理实验结果（上周培养好放冰箱）。快速鉴定，快速鉴定接种，周二菌株号鉴定板类型鉴定结果 VP In do le 乳糖甲基红柠檬酸淀粉硫化氢（未作）氧化酶形态和 G 鉴定拉丁名中文名可信度大肠杆菌 RSE Escherichia coli 大肠杆菌 0.9952 －＋ (+) ＋－－－－杆 G －紫红色细菌 RSE Shewanella putrefaciens 腐败西瓦氏菌 0.9815 + － - + ＋＋ - ？＋杆 G －枯草芽孢杆菌 RGP 未鉴定出＋－ - ＋－＋？金黄色葡萄球菌 RGP Staphylococcus saccharolyticus Or Staphylococcus lentus 解糖葡萄球菌或缓慢葡萄球菌 0.9512 0.9589 地衣芽孢杆菌 RGP 未鉴定出藤黄微球菌 RGP Kocuria rosea 0.9877 氧化酶实验试剂：N,N- 二甲基对苯二胺盐酸盐 N,N-dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride

周三菌株号鉴定板类型鉴定结果 VP In do le 甲基红柠檬酸淀粉硫化氢（未作）氧化酶形态和 G 鉴定拉丁名中文名可信度肠杆菌 RSE（假）紫红色细菌 RSE（假）未知一 RGP Bacillus cereus 腊状芽孢杆菌 0.997 未知二 RGP Bacillus cereus 腊状芽孢杆菌 0.997 柠檬酸盐产酸变黄 RGP Brevibacillus brevis 0.8346 1202 RGP Staphylococcus lentus 0.997

周五菌株号鉴定板类型鉴定结果 VP In do le 甲基红柠檬酸淀粉硫化氢（未作）氧化酶形态和 G 鉴定拉丁名中文名可信度金 RGP 枯 RGP 地 RGP 未知三 RGP 未知一 RGP (假) 未知三 RGP（假）

第 6 次实验：霉菌观察（根霉用斜面，别的用平板）霉菌观察：根霉，青霉，米曲霉晚上：霉菌观察：镰刀菌，交链孢霉，构巢曲霉，第 7 次实验：消毒下午：配牛肉膏蛋白胨培养基（10 人一配分五瓶，100mL/150mL 三角瓶用于倒四个平板）、分装无菌水、中和剂、PBS、准备移液管等（具体量看附件），移液管干热灭菌，别的小锅灭菌。第 8 次实验：放线菌抗菌活性菌株筛选――选择性分离（开始安排让教学实习研究生开始作酵母多糖发酵与多糖含量测定预备试验）下午：配培养基，高氏，牛肉膏（用于抑菌实验）无菌水等晚上：分离，两个浓度，每个浓度 2 板。 10-3 取 0.5mL，10-4 取 0.5mL，第二天：(第一天实验较乱，今天实验分组和内容都有所改变，如下：) （牛肉膏蛋白胨培养基原来实验剩很多，购周三周五两天实验用，周三周五同学不配该培养基，以后该实验的牛肉膏蛋白胨培养基放在消毒实验中一起配制。周一剩余的高氏一号培养基够用于学生标准菌种，周三周五剩余的不再需要，倒掉处理，免占玻璃容器。）第 9 次实验：菌株筛选（同时老师准备酵母子囊孢子）下午：放线菌菌落形态观察，计数，挑菌纯化（平板到平板：点板，一板/人， 4-5 点/板（只作一个指示菌――枯草），平板到斜面，每人两只斜面），晚上：放线菌显微形态观察（老师提供一株，学生还可以直接平板挖菌落印片）。教学实习研究生对酵母多糖发酵预备试验（实验方法大略按讲义，有些地方做了修改：仍然稀释 3 倍离心去菌体，但定容于 50mL）。 nongdu 20 40 60 80 100 样品 OD490nm 0.154 0.327 0.439 0.66 0.77 0.273

甘露糖标准曲线（11.24）－－OD—浓度 y = 0.0078x + 0.0005 R2 = 0.9901 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 20 40 60 80 100 120 ug/mL OD490nm 甘露糖标准曲线（11.24）－－浓度-OD y = 126.53x + 0.5294 R2 = 0.9901 0 20 40 60 80 100 120 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 OD490nm ug/mL 样品测定多糖含量（ug/mL ）＝126.53×样品测定 OD490nm值+ 0.5294 样品测定多糖含量（ug/mL ）＝35.07ug/mL，酵母发酵液胞外多糖含量(ug/mL) ＝样品测定多糖含量（ug/mL ）×50×3＝5.26mg/mL。其 OD490nm值在标准曲线下端，而且还是定容 50mL 来测定的，如果学生定容 100mL 来测量， OD490nm值可能太小将可能在标准曲线外，实验将不理想，因此建议在去除菌体离心时，不稀释三倍，而是直接用发酵液进行离心去菌体，之后定容于 100mL 进行测定。酵母发酵液胞外多糖含量(ug/mL)＝样品测定多糖含量（ug/mL ）×100 学生 OD490nm值将在 0.41 左右。第 10 次实验：酵母观察、多糖发酵，菌株筛选（上周遗留）下午：培养基配制（液体），抗菌－倾注第二层的指示菌层到放线菌平板，（课后观察测定抑菌圈大小）

晚上：酵母形态观察（子囊孢子观察）。接种发酵（液体种子，老师准备），第 11 次实验：多糖测定下午：多糖提取测定，晚上：