厦门大学：《现代生物实验学》课程教学课件（PPT讲稿）lab-2单向琼脂免疫扩散

一 教学要求 ⚫ 学习免疫沉淀反应的原理，了解免疫沉 淀反应的类型 ⚫ 掌握单向琼脂扩散实验的操作方法 实验二 单向琼脂扩散试验

一 教学要求 ⚫ 学习免疫沉淀反应的原理，了解免疫沉 淀反应的类型 ⚫ 掌握单向琼脂扩散实验的操作方法 实验二 单向琼脂扩散试验

二 实验原理 ⚫ 免疫沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在有 电解质存在的情况下，按适当比例所形成的可 见沉淀物现象。据此现象设计的沉淀实验主要 包括絮状沉淀试验，环状沉淀试验和凝胶内的 沉淀试验。凝胶内的沉淀试验依所用的实验方 法又可分为免疫扩散实验和免疫电泳技术2类

二 实验原理 ⚫ 免疫沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在有 电解质存在的情况下，按适当比例所形成的可 见沉淀物现象。据此现象设计的沉淀实验主要 包括絮状沉淀试验，环状沉淀试验和凝胶内的 沉淀试验。凝胶内的沉淀试验依所用的实验方 法又可分为免疫扩散实验和免疫电泳技术2类

⚫ 单向琼脂扩散扩实验是凝胶内免疫沉淀反应定 量试验，一般是用已知抗体测定未知量的相应 抗原。定量抗体与加热熔化的含缓冲液的琼脂 混合后，制板，打孔，加入待检抗原，在合适 条件下，形成乳白色的沉淀环。 ⚫ 沉淀环大小与抗原（抗体）量成正相关，因而 可以根据沉淀环的大小确定相应抗原（抗体） 的量。 ⚫ 单向免疫扩散试验主要用于血清中IgG、IgM、 IgA和补体等蛋白质的定性、定量测定

⚫ 单向琼脂扩散扩实验是凝胶内免疫沉淀反应定 量试验，一般是用已知抗体测定未知量的相应 抗原。定量抗体与加热熔化的含缓冲液的琼脂 混合后，制板，打孔，加入待检抗原，在合适 条件下，形成乳白色的沉淀环。 ⚫ 沉淀环大小与抗原（抗体）量成正相关，因而 可以根据沉淀环的大小确定相应抗原（抗体） 的量。 ⚫ 单向免疫扩散试验主要用于血清中IgG、IgM、 IgA和补体等蛋白质的定性、定量测定

三 材料与器材（略)

三 材料与器材（略)

四 操作步骤 （1）制备抗体琼脂凝胶板：用生理盐水配制1.5%琼脂凝胶， 置水浴中煮沸熔化后，移置56℃水浴箱中保温。吸取 56℃的熔化琼脂置小烧杯内，加入羊抗人IgG抗体（1： 60，v/v）。 （2）铺胶：取溶化的琼脂4ml趁热均匀浇注于载玻片上， 厚度约为1.5mm。 （3） 打孔：待琼脂凝固后，用打孔器在琼脂板上打孔，孔 径3～4mm，孔距10mm。 （4） 加样：将待检血清用生理盐水稀释成1：2、1：6、1： 10 以及空白（生理盐水）加入各孔中，每孔10ul。 （5） 扩散：加样完毕，将琼脂板平放于湿盒内，置37℃ 24～28小时后观察结果

四 操作步骤 （1）制备抗体琼脂凝胶板：用生理盐水配制1.5%琼脂凝胶， 置水浴中煮沸熔化后，移置56℃水浴箱中保温。吸取 56℃的熔化琼脂置小烧杯内，加入羊抗人IgG抗体（1： 60，v/v）。 （2）铺胶：取溶化的琼脂4ml趁热均匀浇注于载玻片上， 厚度约为1.5mm。 （3） 打孔：待琼脂凝固后，用打孔器在琼脂板上打孔，孔 径3～4mm，孔距10mm。 （4） 加样：将待检血清用生理盐水稀释成1：2、1：6、1： 10 以及空白（生理盐水）加入各孔中，每孔10ul。 （5） 扩散：加样完毕，将琼脂板平放于湿盒内，置37℃ 24～28小时后观察结果

○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 打孔方案

○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 打孔方案

五 注意事项 ⚫ 制备抗体琼脂板时，琼脂温度必须严格 控制。温度太低会导致琼脂凝固，太高 将影响所加抗体的活性。 ⚫ 加样孔中的琼脂应挑干净，且不可损坏 孔的边缘，确保每孔的液面基本一致

五 注意事项 ⚫ 制备抗体琼脂板时，琼脂温度必须严格 控制。温度太低会导致琼脂凝固，太高 将影响所加抗体的活性。 ⚫ 加样孔中的琼脂应挑干净，且不可损坏 孔的边缘，确保每孔的液面基本一致

六 思考题 ⚫ 分析试验结果并探讨试验要点

六 思考题 ⚫ 分析试验结果并探讨试验要点