复旦大学：《分析化学》课程实验教学课件（仪器分析）荧光分光光度法测定面粉中核黄素

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实验14 分子荧光分光光度法测定面粉中的核黄素 分子荧光分光光度法测定面粉中的核黄素 分子荧光分光光度法测定面粉中的核黄素 （维生素 B2） 18:08:34 18:08:34 18:08:34 复旦化学系 教学实验中心

实验目的 方法原理 FL-4500荧光分光光度计 四、实验步骤 五、数据处理 六、思考题 :时:

一、实验目的 二、方法原理 三、FL-4500荧光分光光度计 四、实验步骤 五、数据处理 六、思考题 18:08:34 18:08:34 18:08:34

实验目的 掌握面粉样品的消化方法,了解溶液的p值等对核黄素 荧光强度的影响。 2.了解荧光分光光度计的主要结构及工作原理,掌握其正 确使用方法。 3.掌握荧光分析法基本原理和实验方法 :时:

一、实验目的 18:08:34 18:08:34 18:08:34 1. 掌握面粉样品的消化方法，了解溶液的pH值等对核黄素 荧光强度的影响。 2. 了解荧光分光光度计的主要结构及工作原理，掌握其正 确使用方法。 3. 掌握荧光分析法基本原理和实验方法

方法原理 1.荧光、荧光分子/荧光物质 2.荧光分析法:特点、定量方法 3.荧光分光光度计:结构、原理、操作 4.核黄素VB2:结构、性质、面粉中提取方法 :时:

二、方法原理 18:08:34 18:08:34 18:08:34 1. 荧光、荧光分子/荧光物质 2. 荧光分析法：特点 、定量方法 3. 荧光分光光度计：结构、原理、操作 4. 核黄素VB2：结构、性质、 面粉中提取方法

分子发光的基本原理 ◆第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家 N Monardes,1575年他提到在含有一种称为“ Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中,呈现了极为可爱的天蓝 色 ◆直到1852年, Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时,用分光光 度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些,才判断这 种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光,而不 是由光的漫射作用所引起的,从而导入了荧光是光发射的概 念,他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语 令1867年, Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作, 应用铝一桑色素配合物的荧光进行铝的测定。 ◆19世纪以前,荧光的观察是靠肉眼进行的,直到1928年,才由 Jette和Wes提出了第一台荧光计

18:08:34 18:08:34 18:08:34 分子发光的基本原理 分子发光的基本原理 ™第一次记录荧光现象的是 第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家 世纪西班牙的内科医生和植物学家 N.Monardes N.Monardes ， 1575 年他提到在含有一种称为 年他提到在含有一种称为 “ Lignum Nephriticum Nephriticum”的木头切片的水溶液中，呈 的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝 现了极为可爱的天蓝 色。 ™直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光 在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光 度计观察到其荧光的波长比入 度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这 射光的波长稍微长些，才判断这 种现象是这些物质在吸收光能 种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不 后重新发射不同波长的光，而不 是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概 是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概 念，他还由发荧光的矿石 念，他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。 ™1867年，Goppelsroder Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作， 进行了历史上首次的荧光分析工作， 应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定。 桑色素配合物的荧光进行铝的测定。 ™19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到 世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由 Jette和West提出了第一台荧光计。 提出了第一台荧光计

分子发光的类型 光致发光 化学发光生物发光 按激发的模式分 热致发光 类: 场致发光 摩擦发光 荧光「瞬时荧光 按分子激发态的类型分类: 磷光迟滞荧光 按光子能量分类: 斯托克斯荧光 Stokes) 荧光 A emm 反斯托克斯荧光( Antistokes):4x> :时: em 量〓lba

18:08:34 18:08:34 18:08:34 分子发光的类型 分子发光的类型 按激发的模式分 按激发的模式分 类： 按分子激发态的类型分类： 按分子激发态的类型分类： 光致发光 化学发光/生物发光 热致发光 场致发光 摩擦发光 荧光 磷光 瞬时荧光 迟滞荧光 按光子能量分类： 按光子能量分类： 斯托克斯荧光(Stokes) (Stokes)： λex λem 共振荧光(R ) λ 荧光

荧光产生的机制——分子的活化与去活化过程 反系面】1 辐射跃迁的类型 振动弛豫/[内转私 窜趺共振荧光:1012sec 荧光 荧光:103sec 系间磷光 :1~104sec 跃迟滞荧光:102 c10-4seC 外可见吸收光谱紫外 2.无辐射跃迁的类型 振动驰豫:V1012sec 外转移:无辐射跃迁 迟 回到基态 滞荧光 内转移:S2~S能级 光 之间有重叠 可见共振 系间窜跃:S2T能级 之间有重叠 荧 I■■ 光 反系间窜跃:由外部获 光二 l■■■ 取能量后 :: 外转移 T1"S 2

18:08:34 18:08:34 18:08:34 荧光产生的机制 荧光产生的机制——分子的活化与去活化过程

分子荧光(磷光)光谱 1.荧光(磷光激发光谱与发射光谱 荧光(磷光)均为光致发光,在光辐射的作用下,荧光物质发射出不 同波长的荧光。 MX+hv;→MX MX→MX+hv F4800固定an=620nm(MAX A.激发光谱40 固定发射波长 3600 扫描激发波长 ex=290nm( MAX) 2800 2400 2000 1600 0+4+ 200250300350400450500550600650700750800850900 :时:

18:08:34 18:08:34 18:08:34 分子荧光(磷光)光谱 1. 荧光(磷光)激发光谱与发射光谱 激发光谱与发射光谱 荧光(磷光)均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发射出不 同波长的荧光。 A. 激发光谱 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 0 400 800 1200 1600 2000 2400 2800 3200 3600 4000 4400 4800 IF λ 固定λ em=620nm(MAX) =620nm(MAX) λex =290nm (MAX) 固定发射波长 扫描激发波长 MX ⇒ MX* + ∑ = n i 1 hvi ∑ = ⇒ + n j 1 MX MX hv j *

B.发射光谱(荧光光谱) 固定激发波长扫描发射波长 发射光谱的形状与激发波长无关: 分子被激发到S1或者高于S的电子态,经过极快的内转换和振动弛豫 降到S1电子态的最低振动、转动能级,然后以辐射形式释放能量回到基 态 c.激发光谱与发射480固定m=620 nm(MAX)”固定4290mMAX 光谱的镜像关系 44001 1→4 4000 432 S 1→3 1→3 3200 2800 1→2 1600 1200 0 200250300350400450500550600650700750800850900 ■■■ ■圆■ Aox =290nm(MAX) Aem= 620nm(MAX)

18:08:34 18:08:34 18:08:34 B. 发射光谱(荧光光谱) 固定激发波长 扫描发射波长 C. 激发光谱与发射 激发光谱与发射 光谱的镜像关系 光谱的镜像关系 S0 43 2 1 S1 43 2 1 发射光谱的形状与激发波长无关： 分子被激发到S1或者高于S1的电子态，经过极快的内转换和振动弛豫 降到S1电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基 态。 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 0 400 800 1200 1600 2000 2400 2800 3200 3600 4000 4400 4800 IF λ λ ex =290nm (MAX) 固定λ em=620nm(MAX) =620nm(MAX) 固定λ ex=290nm (MAX) λ em= 620nm(MAX) 1→ 4 1→ 3 1→ 2 1→1 1 →1 1 → 2 1 → 3 1 → 4

218荧 Aemnm (a)等角三维投影图 (b)等高线光谱图 三维荧光光谱的两种表示 分子荧光光度法的一些基本概念 ●激发光谱、荧光光谱、三维荧光光谱用途? :时:

18:08:34 18:08:34 18:08:34 三维荧光光谱的两种表示 （a）等角三维投影图 （b）等高线光谱图 分子荧光光度法的一些基本概念 z 激发光谱、荧光光谱、三维荧光光谱 用途？