《生物化学》课程教学课件（PPT讲稿）第八章 核酸（nucleic acid）第六节 核酸的分离与鉴定

第六节核酸的分离与鉴定 一、 核酸的分离 (一)DNA的分离 提取DNA最基本的原则是保持DNA的完整性。 影响完整性的因素： 机械损伤： 细胞内源ONAase(cofactor:Ca2+,Mg2+)的作用； 化学因素

第六节 核酸的分离与鉴定 一、核酸的分离 （一）DNA的分离 提取DNA最基本的原则是保持DNA的完整性。 影响完整性的因素： 机械损伤； 细胞内源DNAase(cofactor: Ca2+,Mg2+)的作用； 化学因素

DNA核蛋白溶解特点： 溶于水和浓盐溶液(1mo/L NaCl) 不溶于生理盐溶液(0.14mol/LNaC1

DNA核蛋白溶解特点： 溶于水和浓盐溶液（1 mol/L NaCl） 不溶于生理盐溶液（0.14 mol/L NaCl）

DNA分离技术要点： DNA提取（浓盐溶液、EDTA、SDS、蛋白质酶K) DNA沉淀（水稀释或异丙醇） 苯酚（水饱和）抽提除去蛋白 乙醇沉淀DNA 氯化铯密度梯度离心进一步纯化

DNA分离技术要点： DNA提取（浓盐溶液、 EDTA、SDS、蛋白质酶K） DNA沉淀（水稀释或异丙醇） 苯酚(水饱和)抽提除去蛋白 乙醇沉淀DNA 氯化铯密度梯度离心进一步纯化

(二)RNA分离 RNA不稳定！ RNA酶非常稳定！！！ 提取RNA的关键在于尽可能完全抑制RNA酶的 活性

（二）RNA分离 RNA不稳定！ RNA酶非常稳定！！！ 提取RNA的关键在于尽可能完全抑制RNA酶的 活性

抑制RNase的措施： 器皿特殊处理 使用蛋白质强变性剂 使用RNAase抑制剂

抑制RNase的措施： 器皿特殊处理 使用蛋白质强变性剂 使用RNAase 抑制剂

RNA制备： 酸性弧盐/苯酚/愾仿抽提 氯化铯密度梯度离心

RNA制备: 酸性胍盐/苯酚/氯仿 抽提 氯化铯 密度梯度离心

二、核酸的超速离心 氯化铯(8.0mol/L) 密度梯度1.80g/cm3→1.55g/cm3 密度：RNA>DNA>蛋白质

二、核酸的超速离心 氯化铯(8.0 mol/L) 密度梯度1.80 g/cm3 1.55g /cm3 密度: RNA>DNA>蛋白质

核酸超速离心的用途： 1.分离核酸（含荧光染科溴化乙锭，EB) 2.核酸构象研究 超螺旋DNA>环状DNA>线型DNA 3.C-G含量测定 p-0.100xc.G+1.658

核酸超速离心的用途: 1. 分离核酸(含荧光染料溴化乙锭, EB) 2. 核酸构象研究 超螺旋DNA>环状DNA>线型DNA 3. C-G含量测定 =0.100 x C-G +1.658

三、核酸电泳 (一)琼脂糖凝胶电泳 1.影响迁移率的主要因素： 核酸分子大小： 胶浓度(EB) DNA的构象（超螺旋>线型>环状）

三、核酸电泳 （一）琼脂糖凝胶电泳 1. 影响迁移率的主要因素: 核酸分子大小; 胶浓度（EB）; DNA的构象(超螺旋>线型>环状)

2.用途 常用于分析DNA(浓度、分子大小、分离) (分析RNA时必须加蛋白质变性剂 Relaxed DNA- 核酸分子量标准 ADNA/Hind II 1 kb ladder Highly supercoiled DNA

核酸分子量标准: DNA/Hind III 1 kb ladder 2. 用途 常用于分析DNA（浓度、分子大小、分离） (分析RNA时必须加蛋白质变性剂)