成都大学：2016届微生物与生化药学学术研讨（PPT讲稿）一种工程菌的构建——以G418为例

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2016届微生物与生化 药学学术研讨

成都大亭 CHENGDU UNIVERSITY 为1份自尊 特聘副研究员,博士。2014.6毕业于四川大学生 物资源与生态环境教育部重点实验蜜,获理学博士学佐。 从事流行病监测、治疗与预防,细菌耐药性及致病机制 相关研究,尤其对病原菌群体效应,细菌种群之间的信 息交流及新型小分子抗菌药物的开发及应用有深入研究, At Nature Communications, Vaccine, Genome Biology and Evolution, Veterinary microbiology, Journal of Medical Microbiology等国际著名期刊发表学术论文7篇。 2012.10获国家建设高水平大学公派研究生项目资格在 国家留学基金委资助下赴美国加州大学洛杉矶分校进行 深造,后改派美国北达科他大学进行联合培养学习; 2014.7于四川大学生物治疗国家重点实验室进行博士后 赵克雷 研究工作。2016.7就职于成都大学四川抗菌素工北研究 所从事新型抗菌素开发研究。 CHENGDU UNⅣ ERSITY

赵克雷 特聘副研究员，博士。2014.6毕业于四川大学生 物资源与生态环境教育部重点实验室，获理学博士学位。 从事流行病监测、治疗与预防，细菌耐药性及致病机制 相关研究，尤其对病原菌群体效应，细菌种群之间的信 息交流及新型小分子抗菌药物的开发及应用有深入研究， 在Nature Communications, Vaccine, Genome Biology and Evolution, Veterinary Microbiology, Journal of Medical Microbiology等国际著名期刊发表学术论文7篇。 2012.10获国家建设高水平大学公派研究生项目资格在 国家留学基金委资助下赴美国加州大学洛杉矶分校进行 深造，后改派美国北达科他大学进行联合培养学习； 2014.7于四川大学生物治疗国家重点实验室进行博士后 研究工作。2016.7就职于成都大学四川抗菌素工业研究 所从事新型抗菌素开发研究

成都大亭 CHENGDU UNIVERSITY 为1份自尊 种工程菌的构建 以G418为例 微生物与生化药学全体成员:刘正洲,钟艾玲, 张君利,郭森林,傅慧垚 嘉宾:赵克雷特聘副研究员 CHENGDU UNⅣ ERSITY

一种工程菌的构建 ——以G418为例 微生物与生化药学全体成员：刘亚洲，钟艾玲， 张君利，郭森林，傅慧垚 嘉宾：赵克雷特聘副研究员

成都大亭 CHENGDU UNIVERSITY 为1份自尊 基本流程 确定目的基因 傅慧垚 刘亚洲 基因敲除 基因表达 张君利 日的基因的导入、检测与筛选}钟艾玲 产物分析 郭森林 CHENGDU UNⅣ ERSITY

确定目的基因 基因敲除 基因表达 目的基因的导入、检测与筛选 产物分析 傅慧垚 刘亚洲 张君利 钟艾玲 郭森林 基本流程

成都大亭 CHENGDU UNIVERSITY 为1份自尊 G418( Geneticin,遗传霉素)σ418是庆大霉素生物合成的中间体, 也是一种氨基糖苷类抗生素,在分子遗传试验中,是稳定转染最常 用的抗性筛选试剂。 但作为中间体是含量很少,且其与其他产 物结构类似,分离提取困难。 t G1008—>庆大霉素高产菌 有没有可能敲除其后续通路,使G418 G418 累积? ogy Grade 012H5o FW4966-19 CHENGDU UNⅣ ERSITY

G418（Geneticin,遗传霉素） G418 是庆大霉素生物合成的中间体， 也是一种氨基糖苷类抗生素 ,在分子遗传试验中，是稳定转染最常 用的抗性筛选试剂。 但作为中间体是含量很少，且其与其他产 物结构类似，分离提取困难。 G1008 庆大霉素高产菌 有没有可能敲除其后续通路，使G418 累积？

成都大亭 CHENGDU UNIVERSITY 为1份自尊 确定目的基因的基本流程? 出发菌 目标物生物合成通路是否清晰 全基因组测序 转座子随机插入突变 性 菌 定位基团簇 株 构建突变子库 确定目的基因 CHENGDU UNⅣ ERSITY

出发菌 YES 目标物生物合成通路是否清晰 NO 全基因组测序 转座子随机插入突变 构建突变子库 阳 性 菌 定位基团簇 株 确定目的基因 确定目的基因的基本流程？

成都大亭 CHENGDU UNIVERSITY 为1份自尊 目标物生物合成通路已知 查询其代谢通路— KEGG PATHWAY NHCH HO HN HO HN H N hN O NH, ger H-N HO O HO HO CH, HO、A CH H. CHNOH H, CHN OH Gentamicin X2 J-20A Sagamicin Cht由图可知,genQ为我 C1JH3NOa(48226) C1H3N2O4(481.27) C3H1N2O(463.30) H, C H,CHN CH 们的目的基因。 H N H, nH HO O HO O HO O 0CH CH HO H, CHN OH H CHN OH H CHNOH G418 J-20B C2HNO3(496.27) C3H1N2O3(495.29 C2HNO3(477.32) 图1庆大霉素的部分生物合成途径 Figure 1 The partial biosynthesis pathway of gentamicin CHENGDU UNⅣ ERSITY

一、查询其代谢通路——KEGG PATHWAY 目标物生物合成通路已知 由图可知，genQ为我 们的目的基因

成都大亭 CHENGDU UNIVERSITY 为1份自尊 目标物生物合成通路不明确 情况:若通过育种得到一株产活性产物∫产物被鉴定岀,但其生物合成途 径尚不完全明确)的菌株 转座子随机 插入突变 筛选 阳性菌株 基因测序 定位基团 明确机制 产量验证 回复突变 CHENGDU UNⅣ ERSITY

情况：若通过育种得到一株产活性产物（产物被鉴定出，但其生物合成途 径尚不完全明确）的菌株 转座子随机 插入突变 筛选 阳性菌株 基因测序 定位基团 明确机制 产量验证 回复突变 目标物生物合成通路不明确

成都大亭 CHENGDU UNIVERSITY 为1份自尊 转座子随机插入突变 转座子( Transposable Element, or transposon) 转座因子或跳跃因子,它可以从遗传物质的一部分跳跃到另一部分, 从而引起遗传变异。 CHENGDU UNIVERSITY

转座子随机插入突变 转座子（Transposable Element , or transposon）： 转座因子或跳跃因子，它可以从遗传物质的一部分跳跃到另一部分， 从而引起遗传变异

成都大亭 CHENGDU UNIVERSITY 为1份自尊 Tn5转座子: 核心序列:编码三个抗生素(新霉素、博莱霉素、链霉素); 两个倒置的50:1S50R编码53KD的Tnp和48KD的转座阻過蛋台 nh),两者使用同一阅读框,但启动子不同。S50L的第1442减基处 存在一个赭石突变(UAA,S50具有19bp的倒置末端,二者有7个碱 基不相同,是转座酶(Tnp)的作用位点。 突变位点 Mutation site OE OE ISSOL kan strr bleo' ISoR P3 PI(Tnp P4 P2 (Inh) CHENGDU UNⅣ ERSITY

kanr strr bleor OE IE IE OE IS50L IS50R P1 (Tnp) P2 (Inh) P3 P4 突变位点(Mutation site) Tn5转座子： 核心序列：编码三个抗生素(新霉素、博莱霉素、链霉素)； 两个倒置的IS50：IS50R编码53KD的Tnp和48KD的转座阻遏蛋白 (Inh),两者使用同一阅读框，但启动子不同。IS50L的第1442碱基处 存在一个赭石突变(UAA)，IS50具有19bp的倒置末端，二者有7个碱 基不相同，是转座酶(Tnp)的作用位点