上海中医药大学：《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教学资源（PPT实验课件）阳性单菌落扩增与小量DNA制备

实验27 阳性单菌落扩增与 小量DNA制备

目的 1.为进一步鉴定重组质粒提供适量的质粒DNA 排除自身环化。鉴定方法主要有： (1)PCR法。采用载体两端的引物进行PCR,一旦插入 成功，则可以在电泳的凝胶中见到与插入片段分子量大小 致的PCR产物。 (2)Southern blot法。将培养皿上的菌落转移到硝酸 纤维素膜上，变性、固定，以插入片段为探针作Southern bIot。重组成功者，在相应的菌落位置上可以见到放射自 显影的黑点，培养皿上对应的菌落即为重组成功者。 (3)酶切鉴定法

2.提供一定数量的DNA以满足一些实验 比如： (1)测序； (2)准备杂交用的探针。 这是该实验的两个主要目的

原理 挑选单一菌落，培养扩增。离心收集扩增了的大肠杆 菌，用碱性液裂解细菌，再经酸性溶液处理形成钾-SDS 蛋白质-膜复合物，离心后，此复合物与细菌染色体DNA、 高分子量的RNA等得到沉淀，而细菌中小分子量的质粒 DNA将溶于上清之中。上清经乙醇沉淀后，得到质粒DNA

实验准备 (参考教材)

实验步骤 1.第一天（通常为下午） 从琼脂平板上挑取单一菌落，接种到Fa|con管内的 5mlLB培养液（含氨卞青霉素或相应的抗生素)中。放入 37C恒温摇床中，225-250rpm剧烈摇晃培养过夜(0/N), 扩增大肠杆菌

2.第二天（通常上午开始） (1)吸取1.5ml培养液，移入Eppendorf管中，台式 离心机室温下1.4万转离心2分钟，弃上清，重复一至二次， 以取得较大的沉淀。剩余培养液存入4℃冰箱

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(2)弃上清，加入100ul溶液1，盖 上盖，剧烈震荡（可以将管底抵于试管架 面上，划15下)，充分浮悬细胞沉淀，置 -20°C冰箱内5分钟。 (3)自冰箱中取出试管，加入200u1 溶液11，轻轻颠倒混匀，放于冰上5分钟 (4)加入150u溶液111，轻轻颠倒混匀，放于冰上 15分钟。 (5)放入台式离心机，室温下1.4万转离心3分钟， 将上清移入一新的Eppendorf管，加入1ml100%乙醇，混 匀，放入-20℃冰箱5分钟。 (6)自冰箱中取出试管，迅速移入4C环境下的台式 离心机，1.4万转离心5分钟，小心弃去上清，倒置试管于 纸巾上流尽乙醇