上海中医药大学：《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教学资源（PPT实验课件）RTPCR

实验9 RTPCR

目的 观察某一特定基因转录量的变化。反转录酶聚合酶链 式反应(RTPCR)以其灵敏度高，要求样品量少，实验周期 短而倍受青睐。有人将RTPCR实验结果与Northern blot 结果等进行比较分析，发现两种不同方法所得到的实验结 果相一致。 类似的有Northern blot、原位杂交，甚至原位PCR 等

原理 首先，以目的基因mRNA为模板，利用反转录酶的活 性，合成对应的cDNA。然后在模板cDNA、目的基因特异 引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依靠Tag DNA 聚合酶的酶促反应，通过变性、退火、延伸的反复循环中， 扩增出大量特异的目的DNA产物。最后，扩增产物通过琼 脂糖凝胶电泳分离，显色，并进行图象分析

实验准备

实验步骤 1.分光光度计检测RNA的浓度与纯度 各样品总RNA取5ul加入1ml水中测0D值，当 0D26/0D20≥1.8时，方可使用。根据以下公式计算RNA的浓 度： 样品总RNA含量(ug/ul)=0D20×稀释倍数X40/1000

2.反转录 水 7ul dNTP (each 10mM) 2ul 5Xbuffer 4ul DTT (100mM) 1ul RNAsin (40U/ul) 1ul 随机引物(100uM) 1ul 组织总RNA 2ul 65℃5min,快速插入冰水中，冰上加入： RNAsin (40U/ul) 1ul M-MLV反转录酶(200U/ul)1ul 37C60min,65℃5min(灭活逆转录酶)。-20C保存

3.PCR扩增 水 20ul dNTP (each 0.5mM) 4ul 10Xbuffer 4u1 MgCl2 (25mM) 4ul 上游引物(4uM) 2ul 下游引物(4uM) 2ul 反转录产物 4ul Tag DNA聚合酶(5U/ul) 0.4ul 石腊油 25u| PCR反应条件为94℃3min; 94C40s,55C1min,72C1min,30个循环； 72℃5min→4℃保存

4.电泳 取PCR产物20ul与上样缓冲液4ul混匀后，上样 于1.6%的琼脂糖凝胶中，其中一孔加DNA marker,80V 电压，电泳1小时。紫外透射仪下查看，并拍照。 5.图象处理 取电泳凝胶的底片，用KS400型图象分析系统进 行光密度扫描，以目的基因光密度值与对应内参基因光 密度值的比值作为该样品中目的基因的相对转录量。最 后以目的基因的相对转录量为参数进行半定量统计分 析

实验结果 在紫外透射仪上，琼脂糖凝胶于DNA marker相应分子 量的位置，可见清晰的DNA条带。 通过光密度值与对应内参基因条带的光密度值的比 值，可作为该基因的相对转录量进行半定量分析

注意事项 1.该实验使用的样品为RNA,因此在反转录过程中，要 特别注意防止RNA酶的污染。为此在反转录过程中除使用RNA 酶抑制剂外，所使用的枪头、试管，水等均建议用DEPC处 理。 2.在做2个样品以上的实验时，不管是反转录反应还 是PC反应都应先配置试剂的共同混合物（共同混合物包括 RNase Free dH0,Buffer,dNTP,Tag酶，MgCl2等)，然后 分装到每个反应管中，以保证各试管不同试剂的用量一致， 减少实验误差，同时还能减少试剂的损失。 3.取反转录酶等酶类时，要轻轻混匀，避免起气泡。 分取之前要轻轻地离心收集到反应管底部，因其粘度高，所 以要慢慢地分取