上海中医药大学：《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教学资源（PPT实验课件）组织总RNA提取

实验6 组织总RNA提取

目的 1.了解某一特定组织或细胞某一特定mRNA转录量的 变化，如RT-PCR、Northern blot等。 2.了解某一特定组织或细胞全部mRNA转录量的变化， 如DD-PCR、基因芯片等。 3.获得某一特定组织或细胞全部mRNA,以便建立cDNA 库等。 4.获得某一特定组织或细胞全部RNA。 以上工作的前提是制备纯净且完整的RNA

现代医学研究表明，人类的绝大多数疾病都是由若 干基因表达的改变所引起的。根据生物学“中心法则”原 理，基因的表达包括转录与翻译两个阶段。其中，由DNA 到RNA的转录过程受到各种因素的调节，其调节水平反映 出某种或某些特定的因素对相关基因表达的调节能力。已 有的研究一再表明，中医药所发挥的治疗与预防作用是直 接或间接调整了基因的转录而实现的。 RNA主要由rRNA(占总量的80-85%)，tRNA和核内 小分子RNA(占总量的10-15%)以及mRNA(占总量的1-5 %)所构成。理论上认为每克组织（或10°个培养细胞) 可提取5-10 mg RNA

提取总RNA的方法有多种，比如： 1)本实验介绍的方法，采用Triz01试剂，或类似 的方法，称为一步法，方便而快捷。缺点是RNA的获得量 偏低，质量不够纯净。 2)超离心方法，可以获得丰富且质量高的RNA。缺 点是实验时间比较长，要求离心过夜。 3)其它一些试剂盒，主要是利用某些特定的介质吸 附RNA,洗去其它杂质，最后洗脱纯净的RNA。可以在短 时间内获得纯净的RNA。但是价格比较昂贵

原 理 本实验类似于“异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法”。方法 采用强RNA酶抑制剂异硫氰酸胍，抑制RNA酶的活性，防 止RNA的降解；酚/氯仿使蛋白质变性。离心后，RNA选 择性地进入无DNA和蛋白质的水相。之后通过异丙醇沉 淀，75%乙醇洗涤等，便可得到较为完整与纯洁的总RNA

实验准备

● 08 BRANSON

实验步骤 (参照GIBC0BRC公司有Trizol试剂盒) 1.引颈处死小鼠，剖腹切取肝脏组织50mg(或10-10 个细胞)，加入1 ml Trizol液，剪碎，快速匀浆。 2.22C,静置5min。 3.加入氯仿0.2ml,颠倒15s。 4.22℃，静置3min。 5.离心：4C×15000转/分×15min。 6.取上清液0.45ml。 7.加入0.45ml异丙醇，混匀

8.22C,静置10min。 9.离心：4C×15000转/分×10min。 10.弃上液。 11.加入1ml4C75%乙醇。 12.离心：4C×10000转/分×5min。 13.弃上液，真空干燥5min。 14.用高压消毒过的去离子水25u1水冰上溶解，-70 C保存。 15.紫外分光光度计测定RNA的含量：

取样本5ul加入石英比色杯内，加入蒸水1m1,充分 混匀。与蒸水对照。读260nm、280nm两个测得值，记录。 计算： 0D2%0为1时，为40 ug RNA,所以计算如下： 样本RNA含量(ug/ul)=0D26*200*40/1000 当0D值260/280<1.8时，提示有蛋白或酚的污染