上海中医药大学：《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教学资源（PPT实验课件）课程总结和部分新技术介绍

课程总结和 部分新技术介绍

一、中医药对基因组作用的研究 实验1基因组DNA提取（方法类似于RNA的提取） 实验2 Southern blot(方法类似于Northern blot)

实验3PCR PCR是Polymerase chain reaction的缩写，中文译作聚 合酶链式反应。其特点是可以在几小时内方便、快捷地将 微量DNA(含由微量RNA反转录成的cDNA)扩增达10 倍，得到ug级的DNA!该技术发明于八十年代中期，到 了八十年代末，由于引用了耐热DNA聚合酶，使这一技术 得以蓬勃发展，成为分子生物学中应用最为广泛的技术之 一，发挥着日益重要的作用。 由于其方便快捷，在中医药实验研究和临床检测中应 用十分广泛。例如观察慢性炎症的活检组织中一些与肿瘤 发生的基因是否存在突变，中医药治疗后防突变的作用如 何（如同一患者气管脱落细胞与血细胞比较）；一些与肿瘤 发生、转归、转移、调亡等基因是否突变、缺失，中医药 的保护与修复如何；以及探针的扩增等等

原理 采用两段引物，分别与DNA两条链上各一段序列 互补，位于模板DNA中拟扩增片段两条链的3'端。加热 使模板DNA变性解链，当反应的温度下降时，两引物分 别与模板DNA两条链发生退火，然后两引物在DNA聚 合酶的作用下延伸。在摩尔数大大过量的两段引物和4 种dNTP的反应体中，位于两段引物间的DNA在反复的 变性、退火、延伸的循环里，每一轮扩增的产物再一次充 当下一轮扩增的模板，使其产物增加一倍。经过30-40个 循环，目的DNA可由原来的lpg扩增到lug。图示如下：

a 双链模板 发性 引物复性 R t恤M0mm.. 延伸 变性 月物复性 0m- 延伸 变性 引物复性 C7K0000 延伸 e 置inmh山

注意事项 PCR的常见问题主要有： 1.没有PCR产物。其主要可能有PCR反应的有关试 剂缺乏，循环次数不够，退火温度太高，引物设计不好， 模版不够，模版质量差，变性温度过高或过低，变性时间 过长或过短，链延伸时间过短，Taq酶数量不够或质量不行， Mg过低，dNTP过少，模版C/G过于丰富，等等。 2.PCR产物不纯，见多条条带产物。其主要可能有 循环次数太多，退火温度过低，引物设计不合理，污染等。 其中，引物设计不合理的可能性最大。 3.PCR产物前后一片，拖带。其主要可能有循环次 数太多，退火温度太低，链延伸时间过长，模版质量差， 模版过多，污染，Taq酶数量过多，Mg"过多，等等

还有一些值得注意的问题： 4.关于引物 (1)引物的长度。引物的长度要求不一，如模版是单 一的载体和单一的插入片段，可以选用较短的插入片段两 侧的载体序列作为引物，一些常用载体有现成的引物商品， 可以购买。对于复杂的基因库，或反转录产物，为提高引 物的特异性，建议采用较长的引物。具体可以参见RACE PCR介绍。 (2)引物的CG与AT的比例。可能的话，建议1：1 左右。 (3)引物的计算机设计参见本书RTPCR介绍。 5.关于酶。一些实验反复失败，竟然会与酶的质量问 题有关。因此，我们建议购买那些经常从事PCR实验的实 验室所经常使用品牌及其供应商的PCR酶

6.退火温度。通常按照检索到的文献或试剂盒提供的 方法，可以确定退火温度。但是，时常会碰到两条引物的 Tm值不一致，或PCR反复调整仍不见改善，此时可以考 虑Touch Down PCR的方法，具体参见本书RACE PCR介 绍。 7.CG丰富的DNA模版往往不容易扩增。对此，可 以采用DMSO(DIMETHYL SULFOXIDE),用量为PCR 反应总容积的1/10。比如将4ul的DMSO加入36ul的PCR 反应液，使总容积达40ul。 8.MgC2。通常PCR buffer中含有MgCL2,但是由于 一些不清楚的原因，有时仍嫌不足，此时可以适当增加 MgCl2的浓度

9.PCR是一种十分灵敏的实验，对操作技巧要求高， 为防止加样误差，建议做复管。同时，同时进行多个反应 时，相同的试剂建议先一道配置，并留有余量，比如Taq 酶、I0×PCR Buffer、dNTP、消毒过的双蒸水等，混匀，这 样可以很大程度上避免上样误差。 10.关于电泳参见本书实验29。 I1.关于试管。为提高PCR的质量，以及大批量PCR 反应的操作，目前业已开发出不同的PCR试管。比如为减 少管壁导热的延滞，发展出超薄壁的PCR试管；为满足批 量实验，发展出排状PC试管，等等。我们在实验中先后 使用过一些不同的试管，从操作方便和安全上看仍喜欢采 用0.5ml的试管。这样的试管比较结实，不宜引起试管的 破裂和同位素的泄漏，且手持起来方便

12.有关实时定量PCR A10.000 ■■■■■■ 1 Hg 100g 10ng 1ng 左上：实时定量 100p9 10p9 PCR仪 =1g 1.000 右上：该仪的部 分工作原理 0 下：实验结果的 0246810121416182022242828303234303840424446 Cycle 输出

12．有关实时定量PCR