新疆大学：《细胞生物学》课程教学课件（PPT讲稿）实验三 扫描电子显微镜样品制备及其观察

实验三 扫描电子显微镜样品制 备及其观察 College of Life Science and Technology,XINJIANG Univercity

实验三 扫描电子显微镜样品制 备及其观察 College of Life Science and Technology, XINJIANG Univercity

实验目的 听取电子显微镜的有关介绍，了解扫描电子显微镜 的基础知识。 。观摩扫描电镜生物样品制备技术演示，了解对扫描 电子显微镜生物样品的基本要求、制备方法及过程。 。了解常规扫描电子显微镜样品制备过程及原理

一、实验目的 ⚫ 听取电子显微镜的有关介绍，了解扫描电子显微镜 的基础知识。 ⚫ 观摩扫描电镜生物样品制备技术演示，了解对扫描 电子显微镜生物样品的基本要求、制备方法及过程。 ⚫ 了解常规扫描电子显微镜样品制备过程及原理

二、 实验原理 电子显微镜是以短波长的电子束为照明源，用电 磁透镜成像，并与特定的机械装置、电子和高真空技 术相结合所构成的现代化大型精密电子光学仪器。 扫描电子显微镜简称扫描电镜，是用电视的方式 成像，用极狭窄的电子束去扫描样品，即电子束在样 品上做光栅运动。电子束与样品作用将会产生各种效 应，其中主要是样品的二次电子发射，二次电子能产 生样品表面放大的性貌像，这个像是样品在扫描时时 序地建立起来的，即使用逐点成像的方法获得放大的 像

二、实验原理 电子显微镜是以短波长的电子束为照明源，用电 磁透镜成像，并与特定的机械装置、电子和高真空技 术相结合所构成的现代化大型精密电子光学仪器。 扫描电子显微镜简称扫描电镜，是用电视的方式 成像，用极狭窄的电子束去扫描样品，即电子束在样 品上做光栅运动。电子束与样品作用将会产生各种效 应，其中主要是样品的二次电子发射，二次电子能产 生样品表面放大的性貌像，这个像是样品在扫描时时 序地建立起来的，即使用逐点成像的方法获得放大的 像

(一)扫描电子显微镜的特点 扫描电子显微镜特点是景深长，图像层次 丰富，立体感强，为三维结构图像。样品制作 简单，不必做超薄切片，且能观察大而厚的样 品，因此应用范围较广，可以广泛应用于生物、 非生物样品的表面及其断面立体形貌的观察

（一）扫描电子显微镜的特点 扫描电子显微镜特点是景深长，图像层次 丰富，立体感强，为三维结构图像。样品制作 简单，不必做超薄切片，且能观察大而厚的样 品，因此应用范围较广，可以广泛应用于生物、 非生物样品的表面及其断面立体形貌的观察

(二)扫描电子显微镜的结构及作用 扫描电子显微镜主要由电子光学系统和 显示单元组成。 电子光学系统：电子光学系统由电子枪、几 个磁透镜、扫描线圈以及样品室组成（实际 上相当于透射电镜的照明系统，它不需要成 像系统)。 显示单元：显示单元包括信号的收集、放大、 处理、显示与记录（即照相）部分

（二）扫描电子显微镜的结构及作用 扫描电子显微镜主要由电子光学系统和 显示单元组成。 ⚫ 电子光学系统：电子光学系统由电子枪、几 个磁透镜、扫描线圈以及样品室组成（实际 上相当于透射电镜的照明系统，它不需要成 像系统）。 ⚫ 显示单元：显示单元包括信号的收集、放大、 处理、显示与记录（即照相）部分

(三)扫描电子显微镜的样品制备方法及过程 1.扫描电子显微镜的样品制备方法 (1)表面复型法：该法是用碳、硅或火棉胶液的薄膜将标本 的表面拓印下来，再在透射电镜观察印在薄膜的精细结构。 此法常用于观察细胞或组织的表面结构。 (2)冰冻蚀刻法：此法是先将样品快速冻结，然后在真空喷 镀仪中用冷刀切小削样品，使其暴露细胞的内部结构，待切 面的冰在真空下升华后，表面喷镀铂碳膜，制成表面复型膜。 从真空取出后，放在蒸馏水中剥离出复型膜，再置入浓硝酸 中将残留的样品溶解，经蒸馏水漂洗后打捞于铜网上，待干 后于电镜下观察。此法常用于观察细胞内部结构，得到的为 生动的立体浮雕图像

（三）扫描电子显微镜的样品制备方法及过程 1．扫描电子显微镜的样品制备方法 （1）表面复型法：该法是用碳、硅或火棉胶液的薄膜将标本 的表面拓印下来，再在透射电镜观察印在薄膜的精细结构。 此法常用于观察细胞或组织的表面结构。 （2）冰冻蚀刻法：此法是先将样品快速冻结，然后在真空喷 镀仪中用冷刀切小削样品，使其暴露细胞的内部结构，待切 面的冰在真空下升华后，表面喷镀铂碳膜，制成表面复型膜。 从真空取出后，放在蒸馏水中剥离出复型膜，再置入浓硝酸 中将残留的样品溶解，经蒸馏水漂洗后打捞于铜网上，待干 后于电镜下观察。此法常用于观察细胞内部结构，得到的为 生动的立体浮雕图像

2.扫描电子显微镜的样品制备过程 由于观察目的不同，除了使用相同的固定液外， 扫描电子显微镜生物样品制备与透电子显微镜射有 较大的差异。为了得到无损、真实而清晰的表面形 貌结构，在扫描电子显微镜样品制备的全过程中都 必须十分小心地保护被观察面，因此在二次电子表 面形貌成像工作状态下，必须满足下述四项基本要 求： ①样品的被观察面应充分的暴露出来（在所要 求的二次电子图像分辨率水平上)，无污染、无皱 缩、无明显的人工损伤及附加结构

2．扫描电子显微镜的样品制备过程 由于观察目的不同，除了使用相同的固定液外， 扫描电子显微镜生物样品制备与透电子显微镜射有 较大的差异。为了得到无损、真实而清晰的表面形 貌结构，在扫描电子显微镜样品制备的全过程中都 必须十分小心地保护被观察面，因此在二次电子表 面形貌成像工作状态下，必须满足下述四项基本要 求： ①样品的被观察面应充分的暴露出来（在所要 求的二次电子图像分辨率水平上），无污染、无皱 缩、无明显的人工损伤及附加结构

②镀一层均匀的重金属导电材料（金、铂、钯铱 和金等)，造成被观察表面的“质量一密度”一致性。 “厚度”即要大于等于入射点子束进入样品的扩散深 度，又不能掩盖样品本身的凹凸形貌结构。同时，样 品表面的二次电子发射率要高。 ③样品、样品与样品托之间导电性要好。 ④能耐受高能量的入射电子和高真空，不变形、 不升华

②镀一层均匀的重金属导电材料（金、铂、钯铱 和金等），造成被观察表面的“质量—密度”一致性。 “厚度”即要大于等于入射点子束进入样品的扩散深 度，又不能掩盖样品本身的凹凸形貌结构。同时，样 品表面的二次电子发射率要高。 ③样品、样品与样品托之间导电性要好。 ④能耐受高能量的入射电子和高真空，不变形、 不升华

在取材时，针对不同的样品、不同的观察要 求，采取不同的技术，使被观察表面充分地暴露 出来；脱水时，为了避免观察表面皱缩变形，设 计了特殊的干燥方法；此外，还必须对样品进行 导电处理，在样品表面喷镀一层厚度适当、均匀 的金属膜

在取材时，针对不同的样品、不同的观察要 求，采取不同的技术，使被观察表面充分地暴露 出来；脱水时，为了避免观察表面皱缩变形，设 计了特殊的干燥方法；此外，还必须对样品进行 导电处理，在样品表面喷镀一层厚度适当、均匀 的金属膜

三、实验仪器、材料和试剂 1.仪器、用具：临界点干燥器、离子溅射仪、 超声波清洗机、电吹风机、磁力搅拌器、干燥器、 抛光膏、刀片、剪刀、镊子、样品盒、酒精灯、 牙签、竹签、培养皿、烧杯、量筒、量杯、注射 器、载玻片、脱脂棉、导电胶。 2.试剂：2.5%戊二醛溶液、1%0S04溶液、 0.2mo1/LPBS溶液、醋酸异戊酯、液体C02、双 蒸水。 3.材料：生物样品（植物花粉、昆虫口器和附 肢)

三、实验仪器、材料和试剂 1．仪器、用具：临界点干燥器、离子溅射仪、 超声波清洗机、电吹风机、磁力搅拌器、干燥器、 抛光膏、刀片、剪刀、镊子、样品盒、酒精灯、 牙签、竹签、培养皿、烧杯、量筒、量杯、注射 器、载玻片、脱脂棉、导电胶。 2．试剂：2.5%戊二醛溶液、1% OSO4溶液、 0.2mol/L PBS溶液、醋酸异戊酯、液体CO2、双 蒸水。 3．材料：生物样品(植物花粉、昆虫口器和附 肢)